血漿和尿液中6 種鵝膏毒肽和鬼筆毒肽的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定

肖紹震，林 鋒，傅武勝,3,4,5,*，魏道智,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；3.福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省疾病預(yù)防控制中心，福建 福州 350001；4.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108；5.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

鵝膏毒肽（amatoxins，AMA）和鬼筆毒肽均屬于雙環(huán)多肽類(lèi)化合物，存在于鵝膏菌屬（Amanita）、盔孢傘屬（Galerina）、環(huán)柄菇屬（Lepiota）的一些野生菌中，其半數(shù)致死量分別為0.3～0.7、1.5～3.0 mg/kg（以體質(zhì)量計(jì)）[1]，前者毒性明顯大于后者。蘑菇食物中毒一直以來(lái)是世界上許多國(guó)家重點(diǎn)關(guān)注的食品安全問(wèn)題之一，多年來(lái)蘑菇中毒也一直是我國(guó)食物中毒事故導(dǎo)致死亡的主要原因[2-3]。我國(guó)僅在2004—2014年，因毒菇導(dǎo)致的食物中毒就達(dá)576起，占食源性中毒起數(shù)的12.2%，導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)全國(guó)食物中毒總致死人數(shù)的35.6%，致死率平均高達(dá)21.2%（786/3 701）。毒菇中毒事故中約90%由于誤食含AMA和鬼筆毒肽的野生菌所引起[4]。蘑菇毒素不僅使野生菌產(chǎn)品的質(zhì)量安全受到一定影響，更嚴(yán)重影響到人類(lèi)食用野生菌的生命安全。

目前血漿和尿液等生物樣品中鵝膏肽類(lèi)毒素的檢測(cè)方法主要有毛細(xì)管電泳法[5-6]、放射免疫法[7-8]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定[9-10]、高效液相色譜及其質(zhì)譜法[11-18]等，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法能實(shí)現(xiàn)毒素的高通量精確分析而成為目前最主要的方法[19-20]。已有的方法多用于測(cè)定α-AMA和β-AMA 2 種毒素，存在檢測(cè)通量不夠高、假陽(yáng)性、靈敏度低和基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重等問(wèn)題[21-23]。大多數(shù)方法采用乙腈等有機(jī)溶劑進(jìn)行血漿的前處理，這可能導(dǎo)致某些毒素與血漿蛋白共沉淀，從而導(dǎo)致測(cè)定的回收率偏低（低于50%），此外結(jié)果的重復(fù)性也較差[23]。單一α-AMA純品在動(dòng)物體內(nèi)的代謝變化已經(jīng)有較多的研究，如對(duì)犬、豬、SD大鼠和小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多采用靜脈注射或腹腔注射給藥方式[24-28]，但這忽略了毒素經(jīng)口攝入后對(duì)胃腸道的首過(guò)效應(yīng)。目前鮮見(jiàn)采取模仿人類(lèi)食用野生菌的方式，以含多種毒素的野生毒蘑菇給藥豚鼠的報(bào)道。采用向豚鼠經(jīng)口給藥可有效地反映出AMA和鬼筆毒肽經(jīng)胃腸道時(shí)的吸收與代謝情況。本研究通過(guò)對(duì)生物樣品中毒素提取和凈化條件的研究，明顯降低了基質(zhì)干擾和毒素共沉淀造成回收率低的問(wèn)題，建立測(cè)定生物樣品6 種鵝膏肽類(lèi)毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，并對(duì)方法進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證；并通過(guò)毒蘑菇提取液經(jīng)口給藥方式，對(duì)豚鼠體內(nèi)4 種AMA和鬼筆毒肽毒素的代謝規(guī)律進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康豚鼠（普通級(jí)）6 只，體質(zhì)量（275±25）g購(gòu)自閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易公司。

羧基三羥鬼筆毒肽（phallisacin，PSC）（純度99%）、裂皮鵝膏干粉（含α-AMA 4.14 mg/kg、β-AMA 2.01 mg/kg、羧基二羥鬼筆毒肽（phallacidin，PCD）0.327 mg/kg、二羥鬼筆毒肽（phalloidin，PHD）0.496 mg/kg） 福州勤鵬生物科技公司；5 種蘑菇毒素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥90%） 美國(guó)ENZO公司；肝素鈉（克拉瑪爾） 上海譜振生物科技有限公司；乙腈、甲醇、乙酸銨均為國(guó)產(chǎn)色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY型超高效液相色譜儀、BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm） 美國(guó)Waters公司；API 5000串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)AB Sciex公司；AllegraX-15R高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；G-560 E型旋渦混合器 美國(guó)Scientific Industries公司；KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CP 225D電子天平（準(zhǔn)確至0.01 mg） 德國(guó)Sartorius公司；N-EVAPTM 111型氮吹儀 美國(guó)Organomation Associates公司；HLB固相柱（60 mg/3 mL） 福州勤鵬生物科技公司；0.22 μm微孔濾膜（有機(jī)系） 北京開(kāi)源國(guó)創(chuàng)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取6 種蘑菇毒素標(biāo)準(zhǔn)品于6 支10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃避光保存；分別準(zhǔn)確移取1.00 mL該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋并配制質(zhì)量濃度為1.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液；移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用甲醇配制質(zhì)量濃度為0.100 mg/L。

移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，小心氮?dú)獯蹈珊螅瑴?zhǔn)確移取200 μL經(jīng)前處理過(guò)的空白血漿基質(zhì)液配制成質(zhì)量濃度為10.0、40.0、60.0、80.0、100 μg/L的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確移取200 μL經(jīng)前處理過(guò)的空白尿液基質(zhì)液配制成質(zhì)量濃度為2.00、10.0、15.0、20.0、25.0 μg/L的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)

超高效液相色譜條件：B E H C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫程序：0～2.5 min，15% B；2.5～4 min，15%～35% B；4～6 min，35%～99% B；6～8 min，99%～15% B；8.0～8.1 min，99%～15% B；8.1～10 min，15% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓力55 psi（空氣）；氣簾氣壓力30 psi（氮?dú)猓慌鲎矚鈮毫?0 psi（氮?dú)猓蝗肟陔妷?0 V；出口電壓5 V；離子源溫度650 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，監(jiān)測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 AMA和鬼筆毒肽毒素測(cè)定的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for analysis of amatoxins and phallotoxins

1.3.3 裂皮鵝膏提取液的制備

①判斷信息題，提醒自己。信息題的題干所占篇幅往往較大，很好識(shí)別。信息題往往是區(qū)分度很大的試題，無(wú)論是選擇題還是判斷題，提醒自己慢下來(lái)好好作答。②理清信息間的邏輯關(guān)系與教材的結(jié)合點(diǎn)，必要時(shí)通過(guò)畫(huà)圖幫助理解。③問(wèn)答中必有用到信息的地方，有些信息還需要進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取2 份已混勻的裂皮鵝膏干粉0.500 g（精確至0.001 g）至2 個(gè)50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入8 mL超純水，超聲提取15 min，10 000 r/min離心10 min，上清液分別轉(zhuǎn)移至2 個(gè)對(duì)應(yīng)的15 mL離心管中。再次加入7 mL超純水，重復(fù)提取。分別合并提取液至對(duì)應(yīng)的15 mL離心管中。合并2 份提取液至50 mL離心管中，渦旋混勻備用。

1.3.4 豚鼠給藥與血液樣品采樣

健康豚鼠6 只，飼養(yǎng)適應(yīng)3 d后，稱(chēng)質(zhì)量并編號(hào)，給藥前禁食16 h，給予自由飲水。裂皮鵝膏提取液以0.650 mL/100 g（以體質(zhì)量計(jì)）灌胃劑量進(jìn)行經(jīng)口灌胃給藥，準(zhǔn)確記錄給藥時(shí)間。給藥豚鼠分別于給藥后5、15、30 min和1、1.5、2、 4、6、10、24 h等時(shí)間點(diǎn)由眼眶靜脈采血0.5 mL，立即用含1%肝素鈉的離心管收集，3 500 r/min離心15 min，分離血漿，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 血漿樣品中毒素的提取、凈化和濃縮

取0.50 mL全血于1.5 mL塑料管中，靜置30 min后，3 500 r/min離心15 min。準(zhǔn)確移取100 μL上層血漿于另一支1.5 mL塑料管中，加入1 mL超純水稀釋?zhuān)瑴u旋提取1 min。將提取液轉(zhuǎn)入事先用2 mL乙腈、水淋洗平衡好的固相萃取柱，依次用2 mL水和1 mL甲醇-水（15∶85，V/V）淋洗柱子，棄去淋洗液；固相萃取柱真空抽干1 min后用2 mL乙腈-甲醇（8∶2，V/V）溶液洗脫，用2 mL塑料離心管收集全部洗脫液。

將洗脫液于40 ℃氮?dú)獯抵粮珊螅贉?zhǔn)確加入200 μL甲醇-水（3∶7，V/V）溶解并渦旋15 s，然后10 000 r/min離心5 min，移取上清液至200 μL襯管中，備用。

1.3.6 尿液樣品中毒素的提取、凈化和濃縮

取2 mL尿液于2 mL塑料離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心10 min。準(zhǔn)確移取1.0 mL上清液于預(yù)先平衡好的固相萃取柱（60 mg/3 mL）中，其余步驟依照1.3.4節(jié)操作，僅洗脫時(shí)改用1 mL乙腈-甲醇（8∶2，V/V）溶液洗脫，再氮吹、濃縮、過(guò)0.22 μm微孔濾膜后用得到的溶液供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器分析條件的建立

圖1 加標(biāo)基質(zhì)中6 種蘑菇毒素、給藥豚鼠血漿和尿液樣品中蘑菇毒素的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of mushroom toxins spiked in guinea pig plasma and urine (A and B) and mushroom toxins in plasma and urine of orally administered guinea pigs (C and D)

2.2 提取溶劑的選擇

圖2 4 種提取溶劑對(duì)血漿中毒素提取率的影響Fig. 2 Effect of four extraction solvents on the extraction efficiency of toxins from plasma

鵝膏肽類(lèi)毒素易溶于水，且不與血漿蛋白結(jié)合，毒素主要分布在血漿中。為此分別考察水、磷酸-水（4∶96，V/V）、乙腈和甲醇4 種溶劑對(duì)毒素的提取效果。如圖2所示，本實(shí)驗(yàn)利用超純水稀釋、提取，6 種毒素的平均回收率均在87.0%～110.8%之間。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用相關(guān)文獻(xiàn)[29-30]的有機(jī)溶劑（乙腈或甲醇）沉淀法時(shí)，血漿中的纖維蛋白也會(huì)被沉淀，這可能導(dǎo)致部分鵝膏肽類(lèi)毒素被纖維蛋白所包裹，形成共沉淀物，從而導(dǎo)致β-AMA、γ-AMA、PCD和PSC回收率略低，4 種毒素的平均回收率均在62.4%～79.3%之間。參考文獻(xiàn)[23]用磷酸-水（4∶96，V/V）稀釋提取時(shí)，水溶液酸性較大（pH 0.94），可能導(dǎo)致部分β-AMA和PSC在固相萃取凈化過(guò)程中不被保留或無(wú)法被洗脫，因此毒素回收率較低，β-AMA回收率甚至低于20%。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

圖3 洗脫體積對(duì)加標(biāo)樣品中6 種毒素回收率的影響Fig. 3 Effect of elution volume on the recovery of six toxins from spiked samples

由于血漿基質(zhì)中富含血漿蛋白，因此血漿樣品經(jīng)超純水稀釋提取或者有機(jī)溶劑提取后需要經(jīng)過(guò)固相萃取凈化，可減輕基質(zhì)效應(yīng)和保護(hù)色譜柱及質(zhì)譜作用。因此考察HLB柱凈化時(shí)淋洗體積和洗脫體積對(duì)毒素回收率及峰形的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)采用2 mL超純水和1 mL甲醇-水（15∶85，V/V）淋洗時(shí)，在血漿基質(zhì)中，對(duì)比2、3、4 mL的洗脫體積，發(fā)現(xiàn)洗脫液為2 mL時(shí)，洗脫效果最佳。6 種毒素平均回收率均在86.1%～98.1%之間。在尿液基質(zhì)中，對(duì)比1、2、3 mL的洗脫體積，發(fā)現(xiàn)洗脫液為1 mL時(shí)，洗脫效果最佳。毒素平均回收率均在93.0%～116.3%之間，峰形較好，無(wú)基質(zhì)干擾。可能是洗脫液體積增加后導(dǎo)致雜質(zhì)被更多從HLB固相萃取柱上洗脫出來(lái)，導(dǎo)致基質(zhì)抑制效應(yīng)增加，回收率有所下降。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

圖4 血漿和尿液基質(zhì)中6 種毒素的基質(zhì)效應(yīng)考察Fig. 4 Matrix effects of six toxins in plasma and urine matrices

選取HLB柱凈化后的血漿和尿液提取液作為空白基質(zhì)，與6 種毒素進(jìn)行混合、測(cè)定，并與直接用溶劑稀釋的毒素響應(yīng)進(jìn)行比較。如圖4所示，幾乎沒(méi)有抑制作用，或者極低，雖然由于基體成分的影響使得檢出限升高數(shù)倍，但是6 種毒素經(jīng)本方法凈化后測(cè)定在血漿基質(zhì)中平均基質(zhì)效應(yīng)在86.3%～105.1%之間，在尿液血漿基質(zhì)中平均基質(zhì)效應(yīng)在90.9%～102.0%之間（基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)采用100×（基質(zhì)中目標(biāo)物峰面積/純?nèi)軇┲心繕?biāo)峰面積）；比值大于100%表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，比值小于100%表示基質(zhì)抑制效應(yīng)）充分說(shuō)明本方法凈化效果很好，保證了靈敏度和降低了污染。Helfer等[31]采用在線(xiàn)提取方式和渦流色譜模式測(cè)定尿液中β-AMA基質(zhì)抑制效應(yīng)高達(dá)40%。對(duì)于血漿和尿液基質(zhì)加標(biāo)后不進(jìn)行固相萃取凈化處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 種基質(zhì)條件下的目標(biāo)物色譜峰峰形很差，色譜峰出現(xiàn)分叉現(xiàn)象，尿液基質(zhì)中的PHD毒素存在空白基質(zhì)干擾問(wèn)題。同時(shí)，目標(biāo)物的檢出限上升為固相萃取處理的3～8 倍。同時(shí)在樣品測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，不同志愿者的血漿樣或尿樣經(jīng)相同的凈化后，對(duì)同一毒素產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)基本相同。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 檢出限測(cè)定結(jié)果

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，分別以不小于3 倍及10 倍信噪比確定方法的檢出限和定量限。取0.1 mL血漿，按照優(yōu)化后的條件測(cè)定，如表2所示。血漿中6 種鵝膏肽類(lèi)毒素的檢出限和定量限分別為1.0 μg/L和3.0 μg/L。取1.0 mL尿液用于測(cè)定時(shí)，鵝膏肽類(lèi)毒素的檢出限和定量限分別為0.3 μg/L和1.0 μg/L。方法的檢出限與文獻(xiàn)[21]基本一致，能充分滿(mǎn)足血漿、尿液等中毒樣品毒素含量較低的檢測(cè)要求。

表2 血漿和尿液中6 種鵝膏肽毒素的檢出限、定量限、線(xiàn)性范圍和精密度結(jié)果Table 2 LODs, LOQs, linear ranges and precision (RSD) for toxins in plasma and urine extracts

2.5.2 線(xiàn)性范圍測(cè)定結(jié)果

如表2所示，采用基質(zhì)匹配法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，血漿基質(zhì)中毒素含量在10～100 μg/L范圍內(nèi)，其線(xiàn)性關(guān)系良好，6 種毒素的相關(guān)系數(shù)在0.993 5～0.999 1之間。尿液基質(zhì)中毒素含量在2～25 μg/L范圍時(shí)線(xiàn)性關(guān)系也良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99。

2.5.3 準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定結(jié)果

表3 血漿中蘑菇毒素的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n= 6）Table 3 Recoveries and RSDs of mushroom toxins spiked in plasma (n= 6)

表4 尿液中毒素的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of mushroom toxins spiked in urine (n= 6)

用健康志愿者的血漿和尿液作為空白基質(zhì)，分別添加3 個(gè)水平的6 種鵝膏肽類(lèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)水平平行實(shí)驗(yàn)6 次，按照所建立的方法前處理、測(cè)定，并計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），同時(shí)進(jìn)行日間精密度和日內(nèi)精密度的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3、4。血漿中6 種鵝膏肽類(lèi)毒素進(jìn)行10、40、80 μg/L加標(biāo)時(shí)，加標(biāo)回收率在76.8%～106.0%之間，RSD為1.30%～12.00%；尿樣中6 種鵝膏肽類(lèi)毒素加標(biāo)質(zhì)量濃度為2、10、25 μg/L時(shí)，加標(biāo)回收率在89.8%～109.0%之間，RSD為1.94%～10.40%。日間精密度和日內(nèi)精密度的RSD均小于10%（表2）。本實(shí)驗(yàn)加標(biāo)質(zhì)量濃度僅是文獻(xiàn)[10]方法所用加標(biāo)質(zhì)量濃度（1～80 mg/L）的1/1 000，RSD也比該文獻(xiàn)報(bào)道（1%～22%）更理想。說(shuō)明樣品應(yīng)經(jīng)過(guò)HLB柱凈化，明顯降低基質(zhì)干擾。

2.6 AMA和鬼筆毒肽在血漿中的代謝消除規(guī)律

圖5 豚鼠血漿中AMA質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線(xiàn)圖（n=6）Fig. 5 Concentration versus time curves for amatoxins in guinea pig plasma (n = 6)

用上述方法對(duì)給藥豚鼠的血漿樣品進(jìn)行前處理并上機(jī)檢測(cè)，外標(biāo)法定量，所有給藥豚鼠的血漿樣品中α-AMA所有血漿質(zhì)量濃度范圍在小于檢出限到14.6 μg/L之間，β-AMA質(zhì)量濃度范圍在小于檢出限到7.24 μg/L之間，鬼筆毒肽未被檢出。從圖5可以看出，α-AMA和β-AMA均在給藥2 h后血藥質(zhì)量濃度達(dá)到峰值。α-AMA血藥質(zhì)量濃度和β-AMA血藥質(zhì)量濃度峰值分別為14.6、7.24 μg/L。研究發(fā)現(xiàn)毒素在第2～4小時(shí)之間下降趨勢(shì)明顯，4 h時(shí)α-AMA和β-AMA的質(zhì)量濃度分別為4.49、1.97 μg/L。此后下降趨勢(shì)平緩，第24小時(shí)α-AMA含量開(kāi)始下降至檢出限附近，β-AMA則未檢出，這說(shuō)明α-AMA和β-AMA在血漿內(nèi)含量很低且代謝消除迅速。2 h時(shí)的尿液中檢出了給藥時(shí)的全部4 種毒素，α-AMA、β-AMA、PHD和PCD質(zhì)量濃度分別為1 905、627、60.9 μg/L和45.9 μg/L，檢測(cè)結(jié)論與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致，即動(dòng)物體內(nèi)對(duì)AMA的吸收率較低，而鬼筆毒肽基本不被吸收。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立血漿和尿液中6 種鵝膏肽類(lèi)毒素的檢測(cè)方法。采用樣品稀釋后再提取、固相萃取凈化，降低了基質(zhì)抑制效應(yīng)，同時(shí)避免了有機(jī)溶劑提取造成回收率低的問(wèn)題。血漿基質(zhì)中毒素線(xiàn)性范圍含量在10～100 μg/L之間，檢出限和定量限分別為1.0 μg/L和3.0 μg/L；尿液基質(zhì)中毒素線(xiàn)性范圍含量在2～25 μg/L之間，檢出限和定量限分別為0.3、1.0 μg/L，回收率均在76.8%～109.0%之間，RSD為1.30%～12.00%（n=6），滿(mǎn)足生物樣品定量的相關(guān)要求。