真空冷凍干燥橄欖假絲酵母的制備及其對蘋果青霉病的防治

蔡孟軒，鄧麗莉,2，姚世響,2，曾凱芳,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

在果蔬采后生理病害的防治中，利用拮抗微生物對采后果蔬病害進行控制成為近年來的研究熱點[1]。研究發現，在果蔬采后病害控制中具有較好效果的酵母大約有20多種，其主要為假絲酵母屬（Candida）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、畢赤酵母屬（Pichia）、粘紅酵母屬（Rhodotorula）和絲孢酵母屬（Trichosporon）等[2-5]。假絲酵母屬在果蔬采后病害控制中應用較多，諸多研究發現其在果蔬采后的病害控制中具有較好效果。Arars[6]通過電鏡觀察發現，拮抗菌無名假絲酵母（Candida famata）可以在病菌菌絲上定植，并促使菌絲裂解；研究發現，橄欖假絲酵母（Candida oleophila）能有效抑制蘋果果實上灰霉病病斑直徑的擴展[7]，且當用C. oleophila作用于番木瓜時能降低其自然發病率[8]。但由于液態酵母菌液在運輸和儲存中存在一定的困難，因此將其轉化為固態菌劑并提高其商品化價值尤為重要。

真空冷凍干燥技術是將物料預先凍結到共晶點溫度以下，在一定的真空狀態下，通過升華除去物料中水分的一種干燥方法[9-10]。與其他干燥方式相比，具有脫水徹底、質量輕、利于長期運輸和貯藏的優點[11-12]。在真空冷凍干燥過程中，添加保護劑系統對微生物在凍干過程中的細胞存活率有著較好作用，同時也對貯藏期間細胞穩定性有著一定影響。糖類和蛋白質是應用最廣泛的兩類保護劑[13]，研究表明，海藻糖、脫脂奶粉、蔗糖、乳糖適用于多種酵母。海藻糖可作為微生物碳源，能夠有效提高凍干微生物的存活率，同時它在穩定細胞膜結構和蛋白質結構方面起著重要作用[14]，Yang Chanyuan等[15]對長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）研究，發現單個保護劑作用時，海藻糖添加量10%保護效果最好，其存活率可達53.22%左右。脫脂奶粉則能為干粉提供較輕的疏松多孔結構，使之容易復水，因此可用作一種賦形劑[16]。谷氨酸鈉是一種常用且有效的保護劑，大量研究表明，谷氨酸鈉分子中的—NH2、α-COOH和γ-COOH在凍干過程中發揮保護作用，還可與水作用使干粉保留適量的水分，滿足微生物維持生命的最低需求。此外，谷氨酸鈉還具有抗氧化作用，可抑制三酰甘油的氧化和自由基的形成，防止其對細胞膜造成不可逆轉的破壞。低分子保護劑在凍干過程中的作用方式是與菌體細胞膜磷脂中的磷酸基團或與菌體蛋白質極性基團形成氫鍵，從而保護了細胞膜和蛋白質結構與功能的完整性，而高分子保護劑則是通過“包埋”形式達到保護菌體的效果[17-18]。本實驗通過以C. oleophila為研究對象，采用真空冷凍干燥技術，首先選擇谷氨酸鈉作為抗氧化劑，從糖類和賦形劑中分別篩選出2 種保護劑，再通過正交試驗優化這3 種保護劑，得到真空冷凍干燥C. oleophila的最優保護劑配方，通過蘋果果實發病率和病斑直徑及果實傷口生長動態實驗，比較新鮮C. oleophila和凍干C. oleophila對蘋果果實青霉病的控制效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“紅富士”蘋果產自甘肅靜寧，取大小均一、無機械損傷、成熟度基本一致的果實作為實驗材料。經2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min后，自來水沖洗，晾干備用[19]。

C. oleophila分離自重慶北碚歇馬鎮馮家槽柑橘樹（錦橙447）葉片表面（C. oleophila JX188107.1，同源性99%，分離號FL14）。該菌株于NYDA培養基（酵母膏5 g，牛肉膏8 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL）4 ℃保藏，每2 個月活化1 次。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團安泰有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司；BS-4G振蕩培養箱 金壇市富華儀器有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；PSX-280手提式高壓殺菌鍋 上海申安醫療器械廠；XB.K.25型血球計數板 上海求精生化試劑有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；SL602N高精度電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母懸浮液的制備

活化菌種：在NYDA培養基上28 ℃擴大培養C. oleophila 48 h；液體培養：挑取一環NYDA培養基上的C. oleophila于NYDB培養基中，在180 r/min、28 ℃搖床中培養24 h；離心濃縮：4 000 r/min、4 ℃離心10 min，用無菌水洗滌2 次；血球計數板計數后用無菌水稀釋到1×109、1×108、1×107CFU/mL備用。

1.3.2 擴展青霉菌孢子懸浮液的制備

Penicillium expansum接種于PDA培養基上，25 ℃培養7 d后，用接種環刮取適量擴展青霉孢子，4 層紗布過濾，血球計數板計數，并用無菌水調整濃度至1×105spores/mL的孢子懸浮液，待用。

1.3.3 保護劑懸浮液的制備

所有保護劑按比例溶解到無菌水中以制備保護劑懸浮液，使得最后與酵母懸浮液混合后濃度如實驗方案所示。

1.3.4 保護劑的單因素試驗

固定酵母的初始濃度1×109CFU/mL、冷凍溫度-50 ℃。以無菌水為對照組，單因素試驗分別設置海藻糖添加量1%、5%、10%、15%、20%、25%；乳糖添加量1%、5%、10%、15%、20%、25%；蔗糖添加量1%、5%、10%、15%、20%、25%；山梨糖醇添加量1%、5%、10%、15%、20%、25%；谷氨酸鈉添加量1%、2%、4%、6%、8%、10%；脫脂奶粉添加量1%、5%、10%、15%、20%、25%；β-環糊精添加量1%、5%、10%、15%、20%、25%，考察各因素對存活率的影響。

1.3.5 保護劑的正交試驗

根據保護劑的單因素篩選試驗結果，選擇海藻糖、谷氨酸鈉、脫脂奶粉添加量進行3因素3水平的正交試驗。具體試驗方案見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.6 樣品的制備及真空冷凍干燥

保護劑懸浮液與酵母懸浮液等體積混合得到樣品。參考Siaterlis等[20]的方法并修改。樣品在旋渦混合儀中均勻混合1 min，之后在室溫下孵化60 min，在此過程中不斷搖動以確保酵母與保護劑混合均勻。

為避免其他因素對凍干C. oleophila存活率的影響，固定酵母的初始濃度1×109CFU/mL、冷凍溫度-50 ℃。分裝2 mL的樣品在稱量瓶（40 mm×25 mm）中，-20 ℃冷凍12 h，之后在冷卻溫度為-50 ℃、真空度為1～10 Pa條件下凍干12 h。實驗重復3 次。

1.3.7 C. oleophila酵母存活率的測定

參考Zhao Guoqun等[21]的方法并修改。酵母存活率由凍干前酵母的菌落總數（N0）以及凍干后酵母總數（Nf）所決定，并用每毫升酵母的菌落總數（CFU/mL）表示。凍干前，將稀釋到合適濃度的酵母懸浮液涂布在NYDA平板上。凍干后，每個凍干樣品用2 mL的無菌水溶解，用旋渦混合儀均勻混合1 min，再在室溫下孵化60 min，稀釋到合適的濃度，涂布在NYDA平板上。上述平板均于28 ℃培養48 h。實驗重復3 次，用公式（1）計算存活率：

1.3.8 熒光染色測定C. oleophila存活率

將樣品適當稀釋并根據說明進行染色。通過熒光顯微鏡觀察染色樣品，捕捉明視野和熒光視野下的圖像，對比明視野和熒光視野下的細胞，存活率計算見公式（2）：

1.3.9 凍干C. oleophila對蘋果果實采后青霉病的控制

將果實隨機分成4 組。用無菌打孔器在果實赤道部位等距離打孔（直徑3 mm，深度3 mm），每個蘋果打3 個傷口，每個處理組果實傷口處分別加入20 μL無菌水（陽性對照）、保護劑、凍干酵母（1×108CFU/mL）、液體酵母（1×108CFU/mL）。同孔接種：4 h后，在果實傷口處接入20 μL的1×105spores/mL P. expansum孢子懸浮液。待菌液吸收后，單果包裝，置于25 ℃、相對濕度90%～95%條件下貯藏，定期統計果實發病率和病斑直徑。每個處理重復3 次，每個重復5 個果實。

1.3.10 凍干C. oleophila接種處理后酵母在蘋果果實傷口處的生長動態測定

用無菌打孔器在果實赤道部位等距離處打傷口（直徑3 mm，深度3 mm），每個果實打3 個傷口，每個傷口處分別接入20 μL凍干酵母（1×107CFU/mL）和液體酵母（1×107CFU/mL）。待菌液吸收后，單果包裝，貯藏在25 ℃、相對濕度90%～95%條件下，以接種后1 h測定的酵母菌數為起始值，每1 d取一次樣，用稀釋平板法測定酵母數目。取樣時，用消毒的打孔器取傷口處直徑為10 mm的果肉組織10 份，放入含10 mL無菌水的消毒研缽內研磨至勻漿，稀釋到合適的濃度，涂布在NYDA平板上。上述平板均在28 ℃條件下培養48 h。結果以每傷口處酵母數量（lg（cells/wound））表示。實驗重復3 次[22]。

1.4 數據分析

Excel 2016統計分析所有數據，計算標準誤差并制圖；應用SPSS 22軟件進行方差分析（ANOVA），利用鄧肯氏多重比較對差異顯著性進行分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 酵母真空冷凍干燥保護劑的優化結果

2.1.1 保護劑單因素篩選試驗結果

從圖1A可看出，最有效的保護劑為海藻糖；使用海藻糖作為保護劑時，隨著添加量的增加，酵母凍干粉的存活率先升高后下降，15%海藻糖添加量保護效果較好；由圖1B可知，隨著谷氨酸鈉添加量的增加，酵母凍干粉的存活率先升高后下降，6%谷氨酸鈉添加量酵母存活率最高。從圖1C可看出，最有效的賦形劑為脫脂奶粉；使用脫脂奶粉作為賦形劑時，隨著添加量的增加，酵母凍干粉的存活率先升高后下降，10%脫脂奶粉添加量保護效果最好。根據3 類保護劑的保護效果，選擇海藻糖、谷氨酸鈉、脫脂奶粉3 種保護劑進行復配。

圖1 糖類和山梨糖醇（A）、谷氨酸鈉（B）和賦形劑（C）對真空冷凍干燥C. oleophila存活率的影響Fig. 1 Effects of saccharides and sorbitol (A), monosodium glutamate (B),and excipient (C) on the viability of freeze-dried C. oleophila

2.1.2 保護劑的正交試驗結果

表2為C. oleophila真空冷凍干燥保護劑正交試驗L9（34）設計及結果，表3為該試驗的方差分析。由表2可知，正交試驗所得較優配方條件為A2B2C3，但存活率（64.7%）結果不如組合A2B1C2高（69.7%），綜合考慮可得最優保護劑配方為A2B1C2，即海藻糖添加量15%、谷氨酸鈉添加量2%和脫脂奶粉添加量10%復配，應用該配方凍干C. oleophila的存活率可達69.7%。從表3可看出，海藻糖、谷氨酸鈉、脫脂奶粉添加量的F值分別為1 680.486（P＜0.01）、21.963（P＜0.05）和151.069（P＜0.01），說明海藻糖和脫脂奶粉這兩種保護劑對凍干C. oleophila存活率的影響極顯著，谷氨酸鈉保護劑對凍干C. oleophila存活率的影響顯著。

表2 L9（34）正交試驗設計及結果Table 2 L9 (34) orthogonal array design with experimental results

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance of the experimental results from orthogonal array design

2.2 熒光染色測定C. oleophila存活率

當酵母在未添加任何保護劑情況下進行真空干燥時，約93%的酵母細胞顯示細胞膜受損（圖2A）；當添加優化保護劑配方對酵母進行真空干燥后，結果顯示約38%的酵母細胞死亡（圖2B），與稀釋涂布法測定的存活率結果相符。

圖2 熒光染色測定C. oleophila存活率Fig. 2 Determination of survival rate of yeast by fl uorescence staining

2.3 凍干C. oleophila對蘋果果實采后青霉病的控制效果

圖3 凍干C. oleophila對蘋果果實采后青霉病的控制效果Fig. 3 Effect of reeze-dried C. oleophila yeast on disease incidence and lesion diameter of apple fruit

由圖3可知，接種凍干酵母和新鮮酵母處理的果實發病率和病斑直徑顯著低于對照果實（P＜0.05），對照果實在貯藏第3天發病率達到100%；在5 d的貯藏期內，新鮮酵母和凍干酵母在控制果實發病率和病斑直徑沒有顯著性差異（P＞0.05）。在4 d和5 d的貯藏期內，凍干酵母處理的果實發病率和病斑直徑顯著低于對照組（P＜0.05）。

2.4 凍干C. oleophila接種處理后酵母在蘋果果實傷口處的生長動態結果

圖4 凍干C. oleophila在果實傷口處的生長動態Fig. 4 Population dynamics of freezing-dried C. oleophila inoculated in apple fruit wounds

如圖4所示，凍干酵母和新鮮酵母都能在果實傷口處迅速定植、擴增；在整個貯藏時間內，凍干酵母和新鮮酵母在果實傷口處保持相同的數量級。在第2天時，凍干C. oleophila和新鮮C. oleophila在蘋果傷口處的活菌數達到最高值。從第3天起，凍干C. oleophila和新鮮C. oleophila的活菌數雖略有下降，但基本保持穩定。

3 討 論

大量實驗研究表明，糖醇類試劑是凍干微生物常用于保護劑的有效試劑，但其在不同的菌種中存在差異[21,23]。本實驗研究發現，在所用的幾種糖醇類試劑中，海藻糖效果最好，使用海藻糖作為保護劑時，隨著添加量的增加，凍干酵母粉的存活率先升高后下降。同時發現，山梨糖醇的效果不及糖類，此結果與Abadias等[24]研究相似。在抗氧化保護劑效果實驗中發現，使用谷氨酸鈉作為保護劑時，隨著添加量的增加，凍干酵母粉的存活率先升高后下降，在凍干C. oleophila中可發揮較好的保護效果[25]。在賦形劑的選擇中，最有效的保護劑為脫脂奶粉，這可能是由于在凍干過程中，當脫脂奶粉作為保護劑時可固定凍干酶類，在菌體細胞外能形成蛋白膜從而對凍干酵母進行保護[26]，同時能使凍干C. oleophila的表面形成疏松多孔的結構，這些結果與Zayed等[27]研究結果相似。根據3 類保護劑的保護效果，本實驗選擇海藻糖、谷氨酸鈉、脫脂奶粉3 種保護劑進行復配，并得出最優復配方案為海藻糖添加量15%、谷氨酸鈉添加量2%和脫脂奶粉添加量10%，應用該配方凍干C. oleophila的存活率可達69.7%。

凍干C. oleophila對蘋果果實青霉病控病效果研究表明，凍干酵母和新鮮酵母處理組果實發病率和病斑直徑顯著低于對照果實（P＜0.05），但二者并無顯著差異（P＞0.05），表明將酵母凍干后其活力和生物防治效果與新鮮酵母相比沒有顯著下降，該結果與Melin等[28]的研究結果相似。營養和空間的競爭抑制病原菌的生長是酵母控制果蔬采后病害的機制之一[29-30]，本實驗表明凍干酵母和新鮮酵母都能在果實傷口處迅速定植、擴增；在整個貯藏時間內，凍干酵母和新鮮酵母在果實傷口處保持相同的數量級，這說明凍干酵母在果實傷口處能較快恢復代謝，從而抑制蘋果采后青霉病的發生。