反油酸誘導人臍靜脈內皮細胞轉錄組學及生物信息學分析

邱 斌，孫文佳，劉 瑋，徐同成，劉麗娜，宗愛珍，賈 敏，杜方嶺*

（山東省農業科學院農產品研究所，山東省農產品精深加工技術重點實驗室，農業部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南 250100）

反式脂肪酸是油脂或含油脂的加工食品中比較常見的一種脂肪酸組分。反式脂肪酸中一般以主要反油酸（C18:19t）為主，約占20%～50%。目前已經有很多關于反式脂肪酸和人類健康關系的研究報道[1-4]。Slattery等[5]研究發現，高含量的反式脂肪酸攝入與女性結腸癌的風險具有顯著相關性（其中相對危險度精確估計值1.5）。另外，還有研究發現反式脂肪酸與心血管疾病的發生呈正相關的關系[6-8]。反式脂肪酸所造成的血漿總膽固醇、甘油三酯水平、載脂蛋白B（apoB）水平的升高和血液黏稠度的增加都與冠心病、血栓和動脈粥樣硬化的形成密切相關[9]。Mozaffarian等[10]通過對心臟病患者細胞膜水平的脂肪酸含量的分析發現，攝入反式脂肪酸的生物標志物IL-6、TNF受體等都與炎癥密切相關。

前期已經研究報道C18:19t能通過caspase、Fas/FasL、p53等信號通路誘導內皮細胞損傷和凋亡[11-13]。但是，反式脂肪酸誘導內皮細胞是一個十分復雜的生物學過程，其中涉及大量基因的差異表達以及轉錄因子和miRNA等多種生物因子的調控作用。轉錄組學作為一個在綜合水平上研究生物在某一生理進程中所有基因轉錄及其轉錄調控規律的手段，為研究反式脂肪酸誘導內皮細胞后相關基因變化提供了技術保障。目前，尚無針對反式脂肪酸對內皮細胞轉錄組學的相關報道。本研究通過反式脂肪酸中的C18:19t單體誘導內皮細胞后，通過轉錄組學篩選差異基因，結合生物信息學分析，探尋反式脂肪酸誘導內皮細胞相關基因功能和信號轉導通路，為研究反式脂肪酸對基因表達、信號網絡的調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈內皮細胞HUVECs由山東大學提供。

試劑總RNA提取試劑盒、TBS380 Picogreen試劑盒美國Invitrogen公司；TruSeqTMRNA sample prep Kit試劑盒、cBot TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑盒、HiSeq-TruSeq SBS Kit（300cycles）試劑盒 美國Illumina公司；Certified Low Range Ultra Agarose 美國Bio-Rad公司；低糖DMEM培養基、胰蛋白酶 美國Hycolne公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；C18:19t美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Eppendorf AG CO2培養箱 美國Sheldon公司；1×70-81FZ倒置顯微鏡 日本Olympus公司；2K15型冷凍離心機 美國Sigma公司；cBoT簇生成系統、HiSeq2500測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及樣品處理

將細胞以1×105個/mL接種于培養瓶，待細胞長至融合，收集細胞并用總RNA提取試劑處理，該組作為對照組。反式脂肪酸實驗組同時分別加入C18:19t，使其終濃度分別為200 μmol/L，誘導內皮細胞24 h后，用總RNA提取試劑處理并收集細胞留作轉錄組學檢測，對照組和C18:19t組分別重復3 次。

1.3.2 轉錄組測序

以5 μg total RNA起始量建庫；磁珠法分離mRNA后，離子打斷mRNA（TruSeqTMRNA sample prep Kit）；雙鏈cDNA合成、補平、3’端加A、連接index接頭（TruSeqTMRNA sample prep Kit）；文庫富集，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增15個cycles；2%瓊脂糖膠回收目的條帶（Certified Low Range Ultra Agarose）；TBS380（Picogreen）定量，按數據比例混合上機；cBot上進行橋式PCR擴增，生成clusters；Illumina HiSeq測序平臺，進行2×150 bp測序。

1.3.3 基因差異表達分析

由轉錄組測序所得的數據稱為原始讀段（raw reads），首先對raw reads進行質控，確定測序數據是否適用于后續分析。

在RNA測序分析中，主要通過對定位到基因組區域的測序序列（clean reads）的數量來估計基因的表達水平。依據所有樣本與參考基因組比對的結果，計算每個基因/轉錄本在樣本中的百萬外顯子的堿基片段值（fragments per kilobase million，FPKM），以該值作為基因/轉錄本在樣本中的表達量。最終對所有基因/轉錄本在各組樣本中的表達進行差異顯著性分析，找出相對差異表達的基因/轉錄本，并對其進行可視化分析。衡量基因表達水平的標準為FPKM值，即每1×106條序列中，每個基因以1 000 個堿基為單位，比對上的reads個數。由于各基因堿基長度不同，在分析其特定表達量時，會將比對上的測序條數和其基因長度關聯分析，具體公式如下：

同實驗條件下的基因差異表達分析使用Cuffdiff軟件。差異蛋白篩選標準：倍數變化值≥2，P＜0.05。對3次重復數據進行t檢驗，P值小于0.05為差異顯著，滿足以上要求的基因即被列出。

1.3.4 生物信息學分析

采用OmicsBean（http://www.omicsbean.com:88/）軟件進行生物信息學分析，利用該軟件每個差異表達基因的基因本體（geneontology，GO）富集分析、KEGG通路分析、蛋白質互作（protein-protein interaction，PPI）分析。

2 結果與分析

2.1 基因表達分析結果

基因在不同表達水平的轉錄本，被有效檢測時對數據量的要求不同。因此，高表達量的基因測序時需要較少的數據量就可趨近于飽和；低表達量的基因則需要較大的數據量要求才能保證檢測的準確性。飽和度曲線可以描述不同測序量的條件下各基因的表達檢測是否準確。

圖1 測序飽和度曲線Fig. 1 Sequencing saturation curves

如圖1所示，待測樣本（包括對照組和C18:19t組）測序飽和度較高，大部分中等以上表達量的基因（即FPKM值在3.5以上的基因）在測序reads的40%比對上時已經接近飽和（縱軸數值趨近于1），說明飽和度總體質量較高，該測序量能夠覆蓋絕大多數的表達基因。

結果顯示：C18:19t作用于內皮細胞后，與對照組相比，共檢測到95 條基因顯著變化，其中31 條基因上調，64 條基因下調。具體基因ID及其信息詳見表1。

表1 C18:1 9t誘導內皮細胞表達有顯著差異的基因Table 1 Elaidic acid induced differential gene expression in endothelial cells

續表1

2.2 生物信息學匯總分析

對該所有差異基因GO富集（生物進程、細胞組成、分子功能）和KEGG通路富集結果總數以及顯著（P＜0.05）數目進行匯總，并通過柱形圖（圖2）形式進行直觀展示。

圖2 生物信息分析匯總圖Fig. 2 Summary of bioinformatics analysis

一個基因通常會參與很多的功能或者通路，所以一般GO富集和KEGG通路富集結果總數會遠大于差異表達基因數目，顯著性功能或者通路是指富集到的該功能或者通路是差異顯著的，即置信度比較高，P值越小，置信度越高。通過生物信息學匯總分析，圖2顯示其中生物進程共富集到2 078 條，顯著性富集基因共772 條，關于細胞組成的基因共富集到223 條，其中顯著性富集基因共46 條，關于分子功能的基因共富集到394條，其中顯著性富集基因共122 條。C18:19t作用于內皮細胞后，與對照組相比，共檢測到93條信號通路，其中顯著變化的有11 條。

2.3 GO分析

圖3 GO注釋分析圖Fig. 3 GO annotation analysis

GO是基因本體聯合會（Gene Ontology Consortium）所建立的數據庫。GO總共有3 個本體：生物進程描述分子功能的有序組合；細胞組分描述亞細胞結構、位置和大分子復合物；分子功能描述基因及基因產物個體的功能，達成更廣泛的生物功能。本實驗GO富集分析基于主流的數據庫David 6.7（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）和QuickGO（http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）對篩選的差異表達基因進行GO分類注釋和富集分析。

圖3展示了生物進程、細胞組成和分子功能3 種類別富集分析顯著性排名前20的條目，在生物進程中，包括膽固醇生物合成、膽固醇代謝、脂質代謝、磷酸代謝等與脂質合成代謝相關生物過程占據一半以上，說明反式脂肪酸作用于內皮細胞細胞后，參與了細胞的脂質相關生物過程并對其產生了顯著影響。細胞組成分析結果顯示，其中涉及細胞外區域及膠原蛋白錨定的生物過程共8 條，以bcl3-10基因相關復合物為主的細胞內生物進程2 條，脂質復合物相關生物進程3 條，細胞質相關區域生物進程2 條。細胞定位揭示了反式脂肪酸從內皮細胞細胞膜外到細胞質的不同作用位點，為研究反式脂肪酸在內皮細胞內轉運等生物進程提供了依據。分子功能富集分析結果顯示，其中參與蛋白、前體蛋白等綁定功能4 條，NADPH還原酶、脂酰胺酶、異戊烯轉移酶、氧化還原酶等參與的與脂肪酸合成、代謝相關功能共16 條，分子功能富集結果與生物進程結果一致。

2.4 KEGG通路分析

KEGG（http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）是一個整合了基因組、化學和系統功能信息的數據庫。把差異表達基因信息映射到KEGG數據庫，可以獲得其富集到的KEGG通路。

圖4 KEGG通路富集分析圖Fig. 4 KEGG pathway enrichment analysis

KEGG通路富集分析的結果（圖4）顯示：最顯著的通路為萜類骨架生物合成通路和類固醇生物合成通路，其中類固醇生物合成通路是調控膽固醇從細胞內轉運進入線粒體的關鍵通路[14]。這兩條通路涉及反式脂肪酸誘導的脂肪酸、萜類及其膽固醇等的代謝，在代謝過程中涉及多種酶、輔酶及底物[15]。

結合GO分析中生物進程中細胞定位富集結果，NADPH、脂酰胺酶等多種酶參與了上述通路。類風濕關節炎通路涉及細胞自身免疫等功能，作為該通路的標志蛋白-脂聯素與脂質代謝、動脈粥樣硬化等密切相關[16]。研究報道n-3脂肪酸能夠刺激生長并在心血管疾病[17]和炎癥反應（類風濕關節炎和潰瘍性結腸炎）中起到保護作用[18-19]。相反本研究中發現C18:19t誘導內皮細胞后，類風濕相關炎癥因子表達上調，說明C18:19t誘導了內皮細胞炎癥反應生物進程的發展。反式脂肪酸誘導內皮細胞后，同時參與的還有包括脂肪酸代謝、不飽和脂肪酸合成通路等代謝通路。其中值得關注的兩條通路是JAK-STAT信號通路和腫瘤壞死因子通路。近來有研究發現JAK-STAT信號通路的激活對促進脂肪酸的分解有著重要的調節作用[20]。JAK-STAT信號通路中激活的STATs轉運到核內，調節基因的轉錄，如編碼線粒體解偶聯蛋白2基因和編碼過氧化體增殖物激活型受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor-gamma，PPARγ），進而通過PPARγ對脂肪組織中甘油三酯水解的限速酶激素敏感脂酶進行轉錄調節[21]。γ-亞麻酸能通過小鼠胃腸黏膜系統和血液系統傳遞信號，通過NF-κB、P38/JNK/MAPK、JAKSTAT等途徑調節機體的免疫[22]。研究發現，二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentenoic acid，EPA）等歐米伽多不飽和脂肪酸（ω-3-polyunsaturated fatty acid，ω-3 PUFA）具有下調炎性細胞因子TNF-α、IL-6表達的功能[23]，已有研究報道C18:19t能夠導致內皮細胞TNF-α分泌升高[8]，而本研究發現結果與之相反。但本研究同時發現MMP-1表達上調，在病理情況下如創傷愈合、修復或重塑過程中，MMP-1表達量增加[24]。而本研究發現與炎癥相關的STAT4卻表達升高，相對于實時定量PCR，轉錄組學對于某個基因的表達定性可能會出現誤差或者表達上調分類劃分不準確，后續實驗需要對TNF通路進行實時定量PCR驗證。

2.5 PPI基因互作分析

基因互作基于string數據庫進行分析，string數據庫是蛋白質間預測的功能相關性的一個數據庫，可以搜尋已知蛋白質/基因之間和預測蛋白質/基因之間相互作用的系統。這種相互作用既包括蛋白質/基因之間直接的物理的相互作用，也包括蛋白質/基因之間間接功能的相關性。它除了包含有實驗數據、從PubMed摘要中文本挖掘的結果和綜合其他數據庫數據外，還有利用生物信息學的方法預測的結果。

根據PPI通路圖分析（圖5），反式脂肪酸誘導內皮細胞生物進程主要分為兩大類，一類是以脂肪酸代謝等為主的脂質代謝進程，另一類是包括類風濕關節炎通路和腫瘤壞死因子通路等與炎癥和凋亡相關的生物進程。在互作圖里面，有些基因不僅僅參與了一條信號通路，可能同時參與調控多條信號通路。這些基因為了解反式脂肪酸調控內皮細胞生物進程機制提供了重要靶點。

圖5 信號通路網絡基因互作圖Fig. 5 Gene-gene interaction in signaling pathway network

在脂質代謝過程中，共6 條基因同時參與了至少2 條代謝相關通路，具體如下：1）本研究發現脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FASN）基因同時參與代謝途徑和脂肪酸代謝兩條信號通路。FASN是一種多功能的復合酶，是合成脂肪酸的關鍵酶。FASN的激活被證實與脂肪生成途徑誘導的缺氧和脂肪酸缺乏呈正相關[25]。Vizio等[26]發現脂筏上存在cav-1和FASN相互作用的作用位點。Clarke等[27]發現日糧中多不飽和脂肪酸顯著降低肝臟中的FASN mRNA水平，魚油比紅花油更有效，而軟脂酸甘油酯和三油酸甘油酯對FASN mRNA無影響。通過上述研究，說明C18:19t能通過激活FASN從而干預脂肪酸在體內代謝，最終導致相關基本的發生和發展。2）同時，本研究還發現IDI1基因同時參與代謝途徑和萜類骨架生物合成通路；3）FDFT1、DHCR7同時參與了代謝途徑和甾族化合物生物合成通路；4）ELOVL6、SCD基因同時參與了脂肪酸代謝信號通路和不飽和脂肪酸生物合成通路。

在炎癥和凋亡相關的生物進程中，共4 條基因同時參與了至少2條相關信號通路，具體如下：1）FOS基因同時參與破骨細胞分化通路、類風濕關節炎通路和腫瘤壞死因子通路；2）CTSK基因參與破骨細胞分化通路和類風濕關節炎通路；3）CSF2同時參與類風濕關節炎通路、T細胞受體信號通路、腫瘤壞死因子通路和JAKSTAT信號通路；4）SOCS1同時參與了JAK-STAT信號通路和破骨細胞分化通路。JAK-STAT通路涉及多條基因的顯著表達，包括CSF2、SOCS1、STAT4和IL23。STATs是一個轉錄因子家族，它們對于細胞信號轉導具有至關重要的作用，因此可以作為細胞滲透小分子吸引靶蛋白，它們的活化均依賴分子內Tyr殘基的磷酸化。STAT4是機體自身免疫過程中，調控炎癥的核心。有報道發現在人內皮細胞內，STAT4的磷酸化與JAK1和Tyk2密切相關[28]。IL-23是IL-12細胞因子家族中新的一員，主要由活化的巨噬細胞及樹突狀細胞產生。IL-23在感染、炎癥、自身免疫性疾病及腫瘤免疫中發揮重要的作用。本研究通過PPI互作發現：STAT4轉錄因子被激活，表達上調，同時發現IL-23下調，后續實驗可以STAT4和IL-23為靶點，重點研究JAK-STAT在反式脂肪酸誘導內皮細胞中的調控作用。

3 結 論

實驗利用轉錄組學技術，對反式脂肪酸誘導內皮細胞后，差異表達基因及其相關生物信息學進行了分析。其中共檢測到95 條基因顯著變化，并對顯著表達基因所涉及生物進程進行分類。根據基因互作通路分析，發現反式脂肪酸誘導內皮細胞生物進程主要分為以脂肪酸代謝等為主的脂質代謝進程和腫瘤壞死因子通路等與炎癥和凋亡相關的生物進程。后續可根據生物信息學分析，進行相關通路驗證研究。