響應面法優化植物乳桿菌LPL-1產細菌素發酵條件及細菌素理化性質分析

王 瑤，李 琪，李平蘭*

（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，中國農業大學食品科學與營養工程學院，教育部-北京市功能乳品重點實驗室，北京 100083）

乳酸細菌素是菌體在轉錄翻譯過程中通過核糖體機制合成，并分泌到菌體體外的一類具有抑菌活性的蛋白質或多肽，具有無毒副作用、無抗藥性及易被人體降解的特點，是一種天然的食品防腐保鮮劑[1-2]。目前已經報道了許多新的細菌素及產生菌，如植物乳桿菌LPL-1產生的植物乳桿菌素LPL-1[3]、動物雙歧桿菌B04產生的雙歧桿菌素A[4]與類植物乳桿菌L-ZS9產生的類植物乳桿菌素L-ZB1[5]等，但細菌素的產量嚴重制約了其工業化生產及應用[6]。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是食品發酵工業中常見的益生菌，并且是GRAS（generally regarded as safe）微生物成員[7]，已經被廣泛應用于奶制品、肉制品及果蔬發酵食品中[8-9]。產細菌素的植物乳桿菌不僅具有益生特性，而且具有抑菌特性，在微生物菌群中，細菌素可以作為抗菌肽，抑制有害菌群的增殖[10]，植物乳桿菌素Y[11]、植物乳桿菌素163[12]與植物乳桿菌素JLA-9[13]等可以明顯抑制食源性腐敗菌單核細胞性李斯特菌、沙門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與志賀菌等，因此可以應用于食品的防腐保鮮；可以作為定植肽，促進有益菌群的定植[14]，腸道菌素SN11[15]不僅可以作為飼料添加劑，而且可以調節動物的腸道菌群，促進有益菌定植，因此可以應用于飼料加工領域；同時又能作為信號肽，增強免疫細胞的免疫性，抑制腫瘤細胞的增殖[16]，大腸桿菌素可以抑制腫瘤細胞DNA酶的活性，對癌癥具有一定的抑制作用[17]，因此可以用于醫療健康領域。與抗生素不同，細菌素不僅對食源性致病菌具有抗菌性，而且對人體內蛋白酶具有敏感性，因此，天然的細菌素不僅具有取代抗生素的潛力[18]，而且在食品發酵與食品防腐保鮮領域具有應用潛力。

植物乳桿菌LPL-1不僅是一株新的菌種，而且所產細菌素為新的IIa類細菌素，有作為天然食品生物防腐劑的巨大應用潛力，然而菌體自身所產細菌素的產量比較低，其合成不僅受到自身誘導肽的調控[19]，而且與培養基的組成及培養條件有關。本研究以植物乳桿菌LPL-1為研究對象，采用MRS培養基為基礎培養基，通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗及響應面法優化植物乳桿菌素LPL-1的發酵條件，獲得該菌種產生細菌素的最佳發酵條件，并探究其生化特性，為該菌種產業化生產細菌素提供一定的實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌LPL-1分離自發酵魚，指示菌單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes ATCC 54002）由實驗室保存。MRS培養基各組成成分購自西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DNP-9162恒溫培養箱 上海精宏試驗設備有限公司；YXQ-LS-S高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司；TG-22高速離心機 湖南平凡科技有限公司；SCL-1300垂直潔凈工作臺 北京賽伯樂實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌素的提取

按照1%的接種量將植物乳桿菌LPL-1接種至100 mL MRS培養基，37 ℃靜置培養24 h，8 000 r/min離心15 min收集上清液，按照1∶3比例加入-20 ℃預冷的丙酮，-20 ℃放置1 h取出，8 000 r/min離心15 min收集沉淀，后用-20 ℃預冷的丙酮等體積洗滌脫水，8 000 r/min離心15 min收集沉淀，沉淀室溫干燥用于計算酶活力。

1.3.2 抑菌活性的檢測

采用牛津杯雙層平板擴散法測定細菌素的抑菌活性[20]。將提取的細菌素進行二倍稀釋，取樣100 μL進行抑菌實驗，觀察不到抑菌圈出現的最高稀釋度定義為一個活力單位（1 AU），其倒數即是原液的細菌素相對抑菌效價值（AU/mL）。

效價值標準曲線的制作：將己知效價值的細菌素稀釋為80%、60%、40%與20%，分別取100 μL進行抑菌實驗，以對應抑菌圈直徑為橫坐標，效價值對數為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線的回歸方程為y=0.105x+0.919（R2=0.996）。

1.3.3 單因素試驗

選擇發酵溫度、發酵初始pH值、裝液量、接種量與發酵時間作為影響抑菌活性的主要因素，通過單因素試驗選擇Plackett-Burman試驗的影響因素與水平。

1.3.3.1 發酵溫度的影響

分別以1%接種量接種植物乳桿菌LPL-1，發酵初始pH 6.0，培養溫度分別設為25、30、37、40、45 ℃，培養時間24 h。發酵結束后檢測抑菌活性。

1.3.3.2 發酵初始pH值的影響

分別設置pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0與7.5，以1%接種量接種植物乳桿菌LPL-1，培養溫度30 ℃，發酵24 h結束后，檢測抑菌活性。

1.3.3.3 裝液量的影響

分別設置20%、40%、60%、80%與100%的裝液量，以1%接種量接種植物乳桿菌LPL-1，發酵初始pH 6.0，培養溫度30 ℃，發酵24 h結束后，檢測抑菌活性。

1.3.3.4 接種量的影響

分別設置0.5%、1%、1.5%、2%、3%與5%的接種量接種植物乳桿菌LPL-1，發酵初始pH 6.0，培養溫度30 ℃，發酵24 h結束后，檢測抑菌活性。

1.3.3.5 發酵時間的影響

以1%接種量接種植物乳桿菌LPL-1、發酵初始pH 6.0、培養溫度30 ℃，每隔4 h取樣并測定發酵液的抑菌活性和OD600nm。

1.3.4 Plackett-Burman試驗

根據單因素試驗的結果，從各試驗因素的最大響應區間中選擇高低兩個水平，利用Design-Expert 10.0軟件設計Plackett-Burman試驗，試驗次數選擇N為12。考察發酵溫度、初始pH值、接種量、裝液量和發酵時間5個因素對植物乳桿菌LPL-1產細菌素的影響，具體設計及響應區間如表1所示。通過各試驗的結果以及Design-Expert 10.0軟件對各因素的方差、效應值和貢獻率3 個指標進行分析，為下一步的研究從選取的因素中篩選出最重要的3 個顯著因素。

表1 Plackett-Burman試驗設計Table 1 Code and level of independent variables used for Plackett-Burman design

1.3.5 最陡爬坡試驗

表2 最陡爬坡試驗設計Table 2 Steepest ascent design

根據Plackett-Burman試驗所得到的顯著因素及效應值來設計最陡爬坡試驗的變化方向和變化步長。在所選擇的顯著因素中，若效應值為正，則變化方向表現為增加；若效應值為負，則變化方向表現為減少，最陡爬坡試驗具體設計方案如表2所示。

1.3.6 Box-Behnken響應面試驗

以最陡爬坡試驗中的拐點作為中心點，以Plackett-Burman試驗中的顯著影響因素為試驗因素，以細菌素相對抑菌效價為響應值，通過Design-Expert 10.0軟件設計3因素3水平Box-Behnken響應面試驗。具體方案如表3所示。對效價值進行二次多元回歸方程擬合，得到各因素與響應值之間函數關系的回歸方程，根據試驗生成的等高線和響應面圖確定最優的發酵條件。

表3 Box-Behnken試驗設計Table 3 Code and level of independent variables used for Box-Behnken desgin

1.3.7 模型的驗證

利用響應面模型優化的最佳條件進行發酵實驗，比較模型預測值與實驗值，驗證模型的有效性。

1.3.8 植物乳桿菌素LPL-1生化特性分析

1.3.8.1 熱穩定性

分別于25、60、80 ℃與100 ℃加入粗提的細菌素樣品，處理15 min和30 min，取出，恢復室溫（25 ℃）后進行抑菌實驗，測定抑菌活性，并以25 ℃保存的細菌素樣品為對照，計算各處理組細菌素的相對抑菌效價保留率，研究溫度對細菌素抑菌活性的影響。

1.3.8.2 酸堿穩定性

用3 mol/L的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節磷酸緩沖液pH值為2、3、4、5、6、7、8、9、10，再溶解粗提得到的細菌素沉淀，得到相應pH值處理的細菌素溶液，進行抑菌實驗，測定抑菌活性，研究細菌素樣品在不同pH值處理后抑菌活性的變化。

1.3.8.3 蛋白酶敏感性

將粗提的細菌素調節到各酶的最適pH值，分別加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K，添加量為l.0 g/L，反應時間3 h，將pH值調回到7做抑菌實驗，測定抑菌圈直徑大小，研究樣品對酶的敏感性。

1.3.8.4 細菌素二硫鍵特性

將粗提的細菌素樣品調節pH值至6.5，利用0.01 mol/L二硫蘇糖醇對二硫鍵進行變性。37 ℃放置2 h后，進行抑菌實驗，測定抑菌圈直徑大小，研究二硫鍵的重要性。

1.3.8.5 抑菌譜分析

將各種待測菌雙層平板法培養，進行牛津杯雙層瓊脂平板擴散抑菌實驗，測量抑菌活性，研究該細菌素對不同種類細菌的抑制作用。

1.4 數據處理與分析

每個實驗重復3次，取平均值。采用SPSS 23.0進行單因素方差分析與顯著性差異分析，Design-Expert 10.0進行Plackett-Burman與Box-Behnken試驗設計。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發酵溫度的影響

圖1 發酵溫度對植物乳桿菌LPL-1產細菌素的影響Fig. 1 Effect of fermentation temperature on bacteriocin production from L. plantarum LPL-1

如圖1所示，菌株在30 ℃恒溫發酵時，細菌素的產量最高，相對抑菌效價為315.02 AU/mL，與其他溫度處理組具有顯著差異，所以選擇30 ℃為最佳發酵溫度，進行Plackett-Burman試驗。

據報道，菌體產細菌素的最適溫度差異較大，例如，屎腸球菌RZS C5產細菌素的最適溫度為35 ℃[21]，戊糖乳桿菌31-1產細菌素的最適溫度為30 ℃[22]，擴展短桿菌ATCC 9175產細菌素的最適溫度為28 ℃[23]，本研究植物乳桿素LPL-1的最適產生溫度為30 ℃。

2.1.2 初始pH值的影響

圖2 初始pH值對植物乳桿菌LPL-1產細菌素的影響Fig. 2 Effect of initial medium pH value on bacteriocin production from L. plantarum LPL-1

如圖2所示，菌株在初始pH值為6.5時，細菌素的產量最高，相對抑菌效價達到了351.80 AU/mL，與其他pH值條件具有顯著差異，并且對比于培養溫度優化的結果有顯著提高，所以確定培養基初始pH 6.5為最佳，進行Plackett-Burman試驗。pH值不僅影響了菌體的生長，而且在發酵后期對細菌素與菌體的黏附性具有影響[24]。

2.1.3 裝液量的影響

圖3 裝液量對植物乳桿菌LPL-1產細菌素的影響Fig. 3 Effect of medium volume in fl asks on bacteriocin production from L. plantarum LPL-1

裝液量主要影響發酵過程的溶氧，植物乳桿菌LPL-1為兼性厭氧菌，溶氧對細菌素發酵的影響對細菌素的規模化生產具有參考價值。如圖3所示，當裝液量為80%時，細菌素效價值最高，為361.27 AU/mL，與60%、100%組無顯著差異，基于Plackett-Burman試驗對影響因素的重復性驗證，選擇裝液量為考察因素進行重復性驗證，并且選擇80%裝液量為Plackett-Burman試驗的中心點。

2.1.4 接種量的影響

圖4 接種量對植物乳桿菌LPL-1產細菌素的影響Fig. 4 Effect of inoculum amount on bacteriocin production from L. plantarum LPL-1

如圖4所示，隨著接種量的增加，細菌素的抑菌活性呈下降趨勢，當按0.5%接種量接種發酵時，細菌素的抑菌效價最大，為364.67 AU/mL，但與初始接種量1%無顯著差異?；赑lackett-Burman試驗對影響因素的重復性驗證，選擇接種量為考察因素進行重復性驗證，并且選擇0.5%接種量最低水平，1%為最高水平，進行Plackett-Burman試驗的重復性驗證。

2.1.5 發酵時間的影響

如圖5所示，在穩定期之前，細菌素產量隨著發酵時間的延長而增大，在32 h時達到最大值，細菌素相對抑菌效價為220.33 AU/mL，進入穩定期后，細菌素產量先維持穩定，而后開始下降，表現出與植物乳桿菌LPL-1菌株的生長曲線的一致性。選擇32 h作為最佳發酵時間。發酵時間的延長不僅會降低發酵液的pH值，促進菌體對細菌素的黏附，降低其效價[24]，而且對產業化的生產成本具有重要影響。

圖5 植物乳桿菌LPL-1的生長與抑菌活性曲線Fig. 5 Growth curve and bacteriocin production of L. plantarum LPL-1

2.2 Plackett-Burman試驗結果

在單因素基礎上，Plackett-Burman試驗主要考察單因素的貢獻率與效應值，從而確定主要影響因素。試驗考察發酵溫度、初始pH值、接種量、發酵時間、裝液量5 個因素對植物乳桿菌LPL-1產細菌素的貢獻率。根據各單因素試驗結果選擇的高低兩個水平，將響應區間取值轉化為編碼值“-1”和“1”，其中“-1”代表低水平值，“1”代表高水平值，試驗設計與結果如表4所示。

表4 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 4 Plackett-Burman design with experimental results

用Design-Expert 10.0軟件對Plackett-Burman試驗結果進行效應分析和方差分析，結果如表5所示。

由表5可見，發酵溫度、發酵時間2 個因素的效應值為正，應該增加；而初始pH值、接種量、裝液量3 個因素的效應值為負，應該減小。其中，效應值大小表示各因素對該試驗結果影響的大小，與因素對該試驗貢獻率的結果保持相關性，由貢獻率的大小可得到這5 個因素對模型影響的大小依次為：初始pH值＞發酵溫度＞發酵時間＞裝液量＞接種量。試驗整體因素模型P值為0.005 3，P＜0.05，說明整體模型對試驗結果有顯著影響，Plackett-Burman試驗的結果具有可信度。因此，最終選擇發酵溫度、初始pH值和發酵時間3 個因素進行下一步的最陡爬坡試驗，其余2 個因素則根據每一因素的效應值進行取值，即選擇接種量0.5%、裝液量60%。

表5 Plackett-Burman試驗效應分析Table 5 Effect analysis of independent variables in Plackett-Burman design

2.3 最陡爬坡試驗結果

圖6 最陡爬坡試驗結果Fig. 6 Results of steepest ascent design

如圖6所示，最陡爬坡試驗結果呈現先增高后降低的趨勢，在3號試驗點處出現最高點，該點處發酵溫度30 ℃、初始pH 6.5、發酵時間32 h，此時植物乳桿菌LPL-1產細菌素相對抑菌效價達到最大，最大值為612.37 AU/mL。該點即為下一步培養條件Box-Behnken試驗設計的中心點。

2.4 Box-Behnken響應面試驗結果

利用Design-Expert 10.0軟件對發酵溫度、初始pH值、發酵時間設計3因素3水平的Box-Behnken試驗，結果見表6，方差分析結果如表7所示，所選擇的回歸模型的P值小于0.000 1，表明整體模型對試驗結果具有顯著的影響，具有可信度；而失擬項的P值為0.727 9，大于0.05，失擬項檢驗不顯著，模型選擇適當；該模型的決定系數為0.999 4，校正決定系數0.998 7，表明模型可信度很高。細菌素相對抑菌效價（Y）對發酵溫度（A）、初始pH值（B）和發酵時間（C）的多元二次回歸方程為：

Y=685.33+38.37A-5.11B+10.84C-21.54AB-21.34AC+0.048BC-220.27A2-211.89B2-185.64C2

表6 Box-Behnken試驗設計與結果Table 6 Box-Behnken experiment with experimental results

表7 回歸模型方差分析結果Table 7 Analysis of variance for the regression model

2.5 響應面試驗結果

圖7 各因素交互作用的響應面與等高線圖Fig. 7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on bacteriocin production

如圖7所示，通過方程可知，二次項系數為負值，其所代表的拋物面開口向下，表明方程具有最大值。利用Design-Expert 10.0分析計算，最適培養條件為發酵溫度30.43 ℃、初始pH 6.49、發酵時間32.1 h，最大效價為687.16 AU/mL。

2.6 回歸模型的驗證結果

在上述優化的條件下，根據實際條件，設置發酵溫度31 ℃、初始pH 6.40、發酵時間32 h進行3 次發酵抑菌實驗，以對優化結果進行進一步的驗證。驗證實驗中細菌素相對抑菌效價的平均值為674.29 AU/mL，與預測值擬合度達98.13%，表明優化模型可靠。

2.7 植物乳桿菌素LPL-1生化特性分析

在食品工業中，熱穩定性與酸堿穩定性是影響細菌素活性的重要因素，蛋白酶敏感性與其安全性有關，同時植物乳桿菌素LPL-1二硫鍵結構對其活性影響未知，因此探究其熱穩定性、酸堿穩定性、蛋白酶敏感性與二硫鍵結構對其活性的影響具有重要意義。

2.7.1 熱穩定性

圖8 溫度對細菌素活性的影響Fig. 8 Effects of temperature on stability of plantaricin LPL-1

由圖8可知，隨著處理溫度的升高和處理時間的延長，細菌素相對抑菌效價保留率逐漸降低，但仍保持相對抑菌效價。在60 ℃時，保留率與對照組無顯著差異，表明該細菌素在60 ℃時具有良好的穩定性；在80 ℃時，保留率與對照組有顯著性差異，但效價保留率仍在90%以上，表明細菌素在80 ℃時活性發生了一定的改變，但仍呈現出較好的熱穩定性；在100 ℃時，細菌素相對抑菌效價保留率發生顯著下降，處理30 min后為70.79%，細菌素仍具有一定的穩定性。結果驗證了植物乳桿菌素LPL-1細菌素的良好耐高溫特性，與植物乳桿菌素JLA-9[13]、植物乳桿菌素J23[25]類似，都具有耐高溫特性，因此有利于其在食品加工中的應用。

2.7.2 酸堿穩定性

由圖9可知，該細菌素在pH 2～10范圍內均有活性，并且隨著pH值的上升，細菌素活性呈下降趨勢。細菌素在pH 2～7保持良好的穩定性；在pH 8～10范圍內，保留率顯著下降。結果表明該細菌素適宜的作用條件為pH 2～8，與細菌素LXA[26]、植物乳桿菌素K25[27]相似，同樣適合作為酸性、中性和弱堿性食品中的防腐劑。

圖9 pH值對細菌素活性的影響Fig. 9 Effects of pH value on stability of plantaricin LPL-1

2.7.3 蛋白酶敏感性

表8 蛋白酶對細菌素活性的影響Table 8 Effects of proteases on stability of plantaricin LPL-1

如表8所示，細菌素經胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶處理后，抑菌活性完全喪失，驗證了能被人體中的各種蛋白酶消化，在一定程度上證明了細菌素具有安全性。

2.7.4 二硫鍵特性

表9 二硫鍵變性劑對細菌素活性的影響Table 9 Effects of disul fi de bond denaturants on stability of plantaricin LPL-1

二硫鍵是二級結構的重要組成，與蛋白活性有一定關聯[28]，巰基還原劑主要對細菌素的二硫鍵進行破壞[29]，如表9所示，在二硫鍵經巰基還原劑還原斷裂后，細菌素失去其抑菌活性，說明二硫鍵結構對細菌素的抑菌活性至關重要，具體的斷點位置還需深入分析。

2.7.5 抑菌譜分析

如表10所示，細菌素對植物乳桿菌、唾液乳桿菌和乳酸鏈球菌具有明顯的抑制作用，以上菌種屬于啤酒釀造中常見的污染菌[30]，表明該細菌素對革蘭氏陽性菌具有抑菌能力。其中對食品中常見的腐敗菌（單核細胞性李斯特菌）[31]與致病菌（金黃色葡萄球菌）[32]具有顯著的抑菌效果，表明了其作為食品防腐劑抑制食源性致病菌的應用潛力。

表10 抑菌譜分析Table 10 Antimicrobial spectrum of plantaricin LPL-1

3 結 論

通過單因素試驗與Plackett-Burman試驗，確定影響因素對細菌素相對抑菌活性的影響大小為：發酵初始pH值＞發酵溫度＞發酵時間＞裝液量＞接種量；通過最陡爬坡試驗與Box-Behnken響應面試驗，建立細菌素相對抑菌活性與發酵溫度、發酵時間與發酵初始pH值的二次多元回歸方程，確定最優條件為發酵溫度31 ℃、初始pH 6.40、發酵時間32 h、接種量0.5%、裝液量60%，細菌素相對抑菌效價（674.29 AU/mL）比優化前（292.02 AU/mL）提高1.31 倍，經驗證實驗證明該數據模型合理可靠。通過對植物乳桿菌素LPL-1理化性質的分析，證明了其具有熱穩定性（100 ℃，30 min）、酸堿穩定性 （pH 2～10）、蛋白酶敏感性與抑菌性，二硫鍵對其抑菌活性具有重要影響，因此植物乳桿菌素LPL-1在食品防腐保鮮領域具有安全應用的潛力。