紅曲色素萃取發酵中表面活性劑的分離與重復利用

陳 功，吳振強*

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006）

紅曲霉作為一種絲狀真菌，可以發酵生產多種功能性代謝產物[1]。紅曲色素作為紅曲霉主要的聚酮類次級代謝產物，具有天然、營養、安全等潛在的價值，在亞洲國家廣泛用于食品領域[2]。紅曲色素種類較多，根據顏色一般分為紅、橙、黃3 類。其中常見的紅曲色素主要有6 種，包括兩種黃色素（Y1：monascin、Y2：ankaflavin），兩種橙色素（O1：rubropunctatin、O 2：m o n a s c o r u b r i n）及兩種紅色素（R 1：rubropunctamine、R2：monascorubramine）[3-4]。

紅曲霉深層發酵主要代謝合成胞內色素，菌絲體內積累較多的脂溶性色素會導致反饋抑制，進而影響最終的色素產量[5-6]。滲透萃取發酵作為一種新型發酵技術，近年來廣泛用于紅曲色素的生產[6-7]。通過在發酵培養基中引入生物相容性較好的非離子表面活性劑Triton X-100（TX-100），能夠增加細胞膜通透性，促進胞內色素跨膜分泌到胞外膠束溶液中，進而避免胞內色素反饋抑制，促進色素代謝，提高色素產量[8-11]。

紅曲色素和表面活性劑的分離純化是萃取發酵下游過程中的一個重要難題。有研究報道，使用乙醚直接一步法萃取分離紅曲色素和TX-100，乙醚有機相中能回收較高含量的紅曲色素，并且水相中的TX-100可以使用異丁醇進行回收[12]。Shen Lingjie等[13]通過離子液體[BMIm]PF6進行微乳液萃取分離，能夠回收約80%的紅曲黃色素（TX-100質量濃度未知），但離子液體價格較貴，不利于大規模萃取分離。近期，唐銳等[14]采用有機溶劑微乳液萃取和大孔樹脂吸附聯合分離方法，能夠很好地將TX-100和紅曲色素進行分離；最終黃色素的回收率達到64.5%，TX-100的去除率為97.47%；但此過程中紅曲色素的分離特性及TX-100的回收利用沒有深入研究。

在前期研究的基礎上，進一步探索三氯甲烷萃取-大孔樹脂吸附（trihalomethanes extraction combined with resin absorption，THMS-Resin）法分離萃取發酵液中紅曲色素的相關特性；同時研究回收TX-100重復發酵的萃取性能；另外，考察回收TX-100共萃取發酵下紅曲霉的生長和色素代謝情況；最后，研究TX-100多批次回收重復萃取發酵紅曲霉生長和色素代謝特性，實現萃取劑的反復利用，提高萃取劑的利用價值和萃取發酵的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于發酵的紅曲霉菌株Monascus anka GIM 3.592保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC/GIMCC）；S-8大孔樹脂（強極性，粒徑范圍0.3～1.25 mm） 東鴻化工有限公司。[BMIm]PF6和[BMIm]BF4中國科學院蘭州化學物理研究所；發酵、分離用試劑均為分析純；液相色譜用試劑均為色譜純；葡萄糖、魚粉蛋白胨、硫酸銨、氯化鉀 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ZWYR-D2402型搖床 海智城分析儀器制造有限公司；UV-2802S型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；e2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（包括2998二極管陣列檢測器和SunFire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基制備

PDA培養基：馬鈴薯葡萄糖200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g；蒸餾水1 000 mL，培養基加熱攪拌全部溶解后分裝，121 ℃滅菌20 min。

種子培養基：葡萄糖20 g，魚粉蛋白胨10 g，酵母提取物3 g，磷酸二氫鉀4 g，氯化鉀0.5 g，七水合硫酸鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然，115 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄糖50 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀5 g，氯化鉀0.5 g，七水合硫酸鎂0.5 g，一水合硫酸錳0.03 g，七水合硫酸鋅0.01 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然，115 ℃滅菌20 min。

1.3.2 常規發酵和萃取發酵

菌種培養：保藏在-80 ℃的菌株M. anka GIM 3.592進行活化后，在PDA平板中進行劃線，然后置于恒溫培養箱中30 ℃培養7 d，培養后的種子平板4 ℃保存備用（一般不超過1 個月）。

種子培養：取培養7 d的PDA種子平板，加入6 mL 0.1 g/100 mL的Tween 80溶液洗脫紅曲霉孢子，取3 mL菌懸液（孢子約106個/mL）接種到50 mL種子培養基中，180 r/min、30 ℃搖床培養28～30 h。

常規發酵培養：將培養好的種子液按8%（體積分數）接種量接種到25 mL發酵培養基中，180 r/min、30 ℃搖床培養7 d。

萃取發酵培養：參照常規發酵培養，在接種的同時向發酵培養基中添加40 g/L TX-100。

1.3.3 萃取發酵液中紅曲色素與TX-100的分離

萃取發酵結束后，收集發酵液，8 000 r/min離心10 min，除去菌絲體，上清液用于胞外色素和TX-100分離。分離方法參考唐銳等[14]采用三氯甲烷萃取-堿性樹脂吸附分離-甲醇洗脫色素的方式進行。

三氯甲烷萃取：向上清液中加入等體積的三氯甲烷，充分混勻；10 ℃、80 r/min振蕩過夜，進行兩相萃取；然后得到下層有機溶劑相，記錄相應體積；同時檢測有機相中TX-100質量濃度和色素含量，根據公式（1）和（2）分別計算三氯甲烷對色素和TX-100的萃取率：

式中：A為上清液中色素含量/AU；A1為兩相萃取后有機相中色素含量/AU；V為上清液體積/mL；V1為兩相萃取后有機相體積/mL。

式中：C為上清液中TX-100質量濃度/（mg/mL）；C1為兩相萃取后有機相中TX-100質量濃度/（mg/mL）；V為上清液體積/mL；V1為兩相萃取后有機相體積/mL。

堿性樹脂吸附分離：S-8大孔樹脂的堿性處理參考課題組之前的方法[14]。將堿性S-8樹脂按照5 g/100 mL的比例，加入到三氯甲烷萃取分離后的有機相溶液中，30 ℃、200 r/min振蕩吸附3 h；然后分離樹脂，檢測溶液中殘留的TX-100質量濃度和色素含量，按照公式（3）和（4）分別計算堿性S-8樹脂對色素和TX-100的吸附率：

式中：A0為樹脂吸附前有機相中色素含量/AU；A1為樹脂吸附后有機相中色素含量/AU。

式中：C0為樹脂吸附前有機相中TX-100質量濃度/（mg/mL）；C1為樹脂吸附后有機相中TX-100質量濃度/（mg/mL）。

甲醇洗脫樹脂解吸色素：將上述吸附色素的樹脂分離后，按照原比例（5 g/100 mL）加入含有1 g/100 mL?HCl的甲醇洗脫劑，30 ℃、180 r/min振蕩解吸1 h，共洗脫5次；按照公式（5）計算色素洗脫率：

式中：A0和A1為樹脂吸附前、后有機相中色素含量/AU；V0為樹脂吸附前后有機相體積/mL；A2為洗脫液中色素含量/AU；V2為洗脫液體積/mL。

1.3.4 不同方式回收TX-100重復萃取發酵

THMS-Resin法[14]：分離1.3.3節中堿性S-8樹脂吸附后的有機相溶液，使用氮吹儀除去溶液中的三氯甲烷，獲得TX-100，備用。

離子液體法[13]：向5 mL萃取發酵上清液中加入5 g離子液體[BMIm]PF6（或者[BMIm]BF4，具有較高親水性、極性、高離子電荷、高介電常數等特性），充分混勻， 30 ℃水浴2 h，進行兩相萃取；上相（TX-100）移入新的離心管中，65 ℃水浴進行濁點分離，獲得TX-100，備用。

分別將上述方法（THMS-Resin、[BMIm]PF6、[BMIm]BF4）回收的TX-100以及新的TX-100進行萃取發酵，同時以常規發酵作為參考對照，考察菌體生長和色素代謝的差異。

1.3.5 新-舊TX-100不同比例復配重復萃取發酵

按照唐銳等[14]的方法回收萃取發酵液中的TX-100；將回收的TX-100（舊）和未使用過的TX-100（新）以1∶0、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1的比例進行復配，重復萃取發酵，考察新-舊TX-100不同比例復配萃取發酵對菌體生長和色素代謝的影響。

1.3.6 TX-100多批次回收重復萃取發酵

按照唐銳等[14]的方法，從原始萃取發酵液中回收得到的TX-100定義為第1次回收，將第1次回收的TX-100萃取發酵定義為第1次重復萃取發酵；然后進行第2次回收和第2次重復萃取發酵；依次進行到第5次回收和第5次重復萃取發酵；考察每次重復萃取發酵紅曲霉菌體生長和色素代謝情況。按式（6）、（7）計算各批次回收TX-100進行紅曲霉萃取發酵的胞外、胞內色素相對含量表示萃取效率和代謝能力，按式（8）計算TX-100回收率：

式中：A0為新TX-100萃取發酵胞外色素含量/AU；Ax為各批次舊TX-100萃取發酵胞外色素含量/AU。

式中：B0為新TX-100萃取發酵胞內色素含量/AU；Bx為各批次舊TX-100萃取發酵胞內色素含量/AU。

式中：Cy為各批次萃取發酵液中回收TX-100質量濃度/（mg/mL）；Cx為各批次萃取發酵液中投入TX-100質量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 指標測定

菌體量測定采用質量法[15]；殘糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸法[16]；清除DPPH自由基能力檢測參考Bei Qi等[17]的方法，以VC計（mg/g）。

TX-100質量濃度測定：樣品用甲醇適當稀釋后，使用HPLC法檢測TX-100質量濃度。色譜條件：2998二極管陣列檢測器，C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，進樣量10 μL，流動相甲醇，流速1.0 mL/min，檢測波長277 nm[14,18]。

紅曲色素含量測定：采用UV-2802S紫外-可見分光光度計測定不同樣品中的色素含量，以410、470、510 nm波長處的吸光度（AU）乘以稀釋倍數分別作為混合色素中黃色素、橙色素、紅色素的含量[5,6,8-16,19]。

紅曲色素組分測定：采用HPLC檢測樣品中色素組分[20]，色譜系統包括Waters e2695分離系統和Waters 2998二極管陣列檢測器檢測系統；色譜柱為Sunfire C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃；樣品進樣體積10 μL；流動相包括A相（超純水，添加0.3%磷酸）和B相（乙腈）；洗脫流速1.000 mL/min，采取梯度洗脫（0 min，80% A；25 min，20% A；35 min，20% A；36 min，80% A；40 min，80% A），洗脫時間40 min；二極管陣列檢測器檢測波長200～600 nm記錄色素光譜，提取色譜圖波長410 nm[21]。

2 結果與分析

2.1 有機溶劑萃取-樹脂吸附分離特性

表1 THMS-Resin法分離萃取發酵液中黃色素和TX-100Table 1 Separation of yellow pigment and TX-100 from the extractive fermentation broth by the THMS-Resin method

采用THMS-Resin法分離紅曲霉萃取發酵液中的紅曲色素和TX-100，結果如表1所示。起始的萃取發酵液中黃色素含量為93.78 AU，TX-100質量濃度為38.40 g/L。三氯甲烷萃取后，大部分黃色素和TX-100被萃取到三氯甲烷有機相中；通過檢測計算，有機相中黃色素萃取率達到81.77%，TX-100萃取率達到90.71%。說明三氯甲烷具有很好的色素和TX-100萃取回收能力，但選擇性很差，不能很好的將二者分開。大孔樹脂由于具有孔徑結構和表面功能基團多樣性的特性，被廣泛用于吸附分離不同分子質量的化合物[22-23]。S-8樹脂是一種苯乙烯型極性共聚體大孔樹脂，能夠通過靜電相互作用吸附極性物質[24]。通過堿性S-8樹脂吸附三氯甲烷萃取液，檢測發現樹脂吸附的黃色素含量為65.12 AU（吸附率84.91%），吸附的TX-100質量濃度為0.91 g/L（吸附率2.61%）。樹脂的吸附能力與自身極性、孔徑孔穴大小、比表面積有很大的關系，經過酸堿處理可以改變樹脂表面功能基團的電荷極性，進而影響對目標物質的選擇性吸附效果[25]。說明堿性S-8樹脂能夠很好地將色素和萃取劑分開，TX-100留在三氯甲烷萃取液中，進而可以通過除去三氯甲烷回收TX-100。這一結果與唐銳等[14]的研究基本一致，同時解釋了萃取吸附原理，即三氯甲烷可能破壞萃取發酵液中TX-100-色素混合膠束結構，導致色素從膠束中釋放到有機相；堿性S-8樹脂進而選擇性吸附有機相中游離的色素，實現色素與TX-100的分離。進一步通過鹽酸-甲醇洗脫樹脂吸附的色素，結果顯示，5 次洗脫后的黃色素和TX-100的總洗脫率分別達到74.90%和61.58%；總洗脫液中黃色素含量為48.77 AU，TX-100質量濃度為0.05 g/L。說明通過此方法可以很好地分離萃取發酵液中的萃取劑和紅曲色素，最終獲得幾乎不含TX-100的較高含量的黃色素。

圖1 THMS-Resin法分離過程中色素的HPLC圖譜（A）和DPPH自由基清除能力（B）Fig. 1 HPLC chromatogram (A) and DPPH radical scavenging capacity (B) of pigment separated by the THMS-Resin method

通過HPLC檢測上述THMS-Resin分離過程中色素組分變化情況，圖1A結果顯示，萃取發酵液中含有多種色素成分，除了原有的胞內外色素組分外[26]，還出現一些新的色素成分；鑒定發現，有4 種新的黃色素在萃取分泌過程中通過酶催化橙色素（O1：rubropunctatin、O2：monascorubrin）轉化而來[27]。經過三氯甲烷萃取后，萃取液中色素組分幾乎沒有改變，但單個色素峰譜圖更加清晰；說明三氯甲烷很好地將色素萃取出來，進而分離除去發酵液中的一些雜質。堿性S-8樹脂吸附三氯甲烷萃取液后，發現只有部分色素（Y1：monascin）殘留在萃取液；說明大量的色素被吸附到樹脂中，體現了S-8樹脂的強大吸附能力。經過酸性甲醇溶液洗脫樹脂中的色素，發現洗脫液中含有較多的黃色素，其中包括一些新的色素成分。說明通過上述分離方法最終可以獲得較高含量的黃色素。

有研究報道，紅曲黃色素具有一定的生物活性功能，例如抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗肥胖、抗炎[28-29]。通過檢測THMS-Resin分離過程中色素的抗氧化活性，圖1B結果顯示，與常規發酵（空白）相比，萃取發酵胞外色素具有更高的DPPH自由基清除能力，說明萃取到胞外的色素具有很強的抗氧化活性。通過三氯甲烷萃取后，除去了發酵液中的一些雜質，獲得較純的色素，導致DPPH自由基清除能力進一步提高。堿性S-8樹脂吸附三氯甲烷萃取液色素后，剩余萃取液的DPPH自由基清除能力顯著下降，說明大量的功能活性色素被樹脂吸附。進一步檢測洗脫液中色素的DPPH自由基清除能力，發現抗氧化活性能力達到較高水平，說明分離純化后的紅曲色素具有很高的抗氧化活性。所以，采用萃取發酵技術，分離分泌到紅曲霉胞外的色素具有潛在的抗氧化活性功能，可能來自于這些新的黃色素成分。

2.2 不同方法回收表面活性劑重復用于萃取發酵

圖2 不同方法回收TX-100重復萃取發酵細胞生長（A）和色素代謝（B）情況Fig. 2 Cell growth rates (A) and pigment metabolism (B) in extractive fermentation with the recycled TX-100 by different methods

萃取劑的回收率和回收溶液中含有的雜質成分，在重復發酵時會影響紅曲霉細胞的生長和色素的萃取效率。通過不同方法回收TX-100進行重復萃取發酵，結果如圖2所示。[BMIm]BF4法回收的TX-100重復萃取發酵，葡萄糖利用很少，菌體生長緩慢，幾乎沒有色素產生。可能是[BMIm]BF4法回收的TX-100溶液中含有一些殘留的離子液體，在紅曲霉萃取發酵過程中對細胞毒性較大，抑制了細胞的生長和色素代謝。相反，采用[BMIm]PF6和THMS-Resin法對回收的TX-100進行重復發酵表現出較好的生物相容性；葡萄糖幾乎完全利用，菌體量與正常TX-100萃取發酵相比差別不大，最終均可達到9 g/L左右，并且THMS-Resin法略高于[BMIm]PF6法；但相對于常規發酵（空白），萃取發酵的菌體量均有所下降，說明萃取劑對細胞生長具有一定的抑制作用（圖2A）。另外，采用[BMIm]PF6和THMS-Resin法對回收的TX-100進行重復萃取發酵，可以獲得跟正常TX-100萃取發酵相近的總色素含量，且高于常規發酵，進一步說明萃取發酵可以顯著提高紅曲色素產量。相比[BMIm]PF6法，采用THMS-Resin法對回收的TX-100進行紅曲霉重復萃取發酵，胞外色素含量相對較多（圖2B），說明THMS-Resin法回收的TX-100沒有降低萃取能力，可以用于重復進行紅曲霉萃取發酵，提高色素產量。

2.3 回收表面活性劑部分替代萃取發酵

圖3 新-舊TX-100不同比例共萃取發酵細胞生長（A）和色素代謝（B）情況Fig. 3 Cell growth rates (A) and pigment metabolism (B) in extractive fermentation with new and recycled TX-100 in different proportions

采用THMS-Resin法對回收的TX-100（舊）和未使用過的TX-100（新）以不同比例混合后進行萃取發酵，結果如圖3所示。新-舊TX-100不同比例混合萃取發酵均表現出很好的生物相容性，發酵7 d后葡萄糖基本耗盡，菌體量均達到9 g/L左右；但新TX-100比例相對較高時（＞1∶1），細胞生長抑制相對加強，最終菌體量略有減少（圖3A）。采用新-舊TX-100不同比例進行紅曲霉混合萃取發酵，總色素含量均可以達到160 AU以上，說明紅曲霉均能很好地代謝色素。而采用新-舊TX-100高比例（＞1∶1）混合萃取發酵時，胞內外色素含量均相對較高，從而獲得較高的總色素含量。說明通過回收的舊TX-100部分替代新TX-100萃取發酵，可以促進紅曲霉胞內外色素的代謝與分泌，可能由于回收的舊TX-100膠束中含有少量的微量元素，在重復萃取發酵過程中促進細胞生長和色素代謝。研究顯示，紅曲色素液態發酵過程中，一些金屬離子包括Fe2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+等對色素代謝有很大的調控作用[4,30]。因此，采用新-舊TX-100協同發酵可以在一定程度上減少細胞傷害，促進色素代謝，同時提高色素萃取效率，獲得較高的色素產量。

2.4 多批次回收表面活性劑重復萃取發酵

TX-100經過5 次反復回收和重復萃取發酵，每批次的紅曲霉細胞均能很好地生長代謝，菌體量均維持在8～11 g/L之間，說明TX-100多次重復利用均具有很好的生物相容性。值得注意的是，使用各批次回收的TX-100重復萃取發酵獲得的菌體量比正常萃取發酵略高，相對生長率（舊TX-100萃取發酵菌體量/新TX-100萃取發酵菌體量）均達到1.0以上（表2）。可能由于TX-100批次利用會降低回收的相對含量，進而減少對細胞的毒性和抑制，促進紅曲霉菌體生長；同時說明各批次回收的TX-100可以重復用于萃取發酵。

表2 TX-100多批次回收重復萃取發酵細胞生長和色素代謝情況Table 2 Cell growth rates and pigment metabolism in extractive fermentation with the recycled TX-100 from multiple batches

從色素代謝產量來看，各批次回收的TX-100重復萃取發酵均能獲得較高的總色素含量。與正常萃取發酵相比，各批次回收的TX-100重復萃取發酵可以獲得相同含量的胞外色素，尤其是胞外黃色素相對含量達到1.0以上；同時，胞外橙色素和紅色素相對含量分別達到0.9和0.8以上（表2）。通過計算，5 次重復萃取發酵TX-100的回收率均達到80%左右（圖4），說明采用回收的TX-100進行紅曲霉重復萃取發酵，表現出很好的胞外色素萃取能力，可能與較高的TX-100回收率有關；同時，胞內黃色素相對含量為0.6左右，可能由于回收的TX-100溶液中含有一定的殘余色素和抑制物質，進而影響了胞內色素的代謝。

圖4 TX-100多批次重復萃取發酵回收率Fig. 4 Recovery of TX-100 from multiple batches

圖5 TX-100多批次回收重復萃取發酵胞內外色素可見光譜和HPLC圖譜Fig. 5 Visible spectra and HPLC chromatograms of intracellular and extracellular pigments in extractive fermentation with the recycled TX-100 from multiple batches

5 次重復萃取發酵，各批次胞外色素光譜基本一致，最大吸收峰在430 nm左右，但胞內色素最大吸收峰從470 nm向410 nm轉移，說明胞內色素特性發生變化（圖5A、B）。通過HPLC分析發現，5 次重復萃取發酵胞外色素組分和相對比例基本一致，但胞內黃、橙色素相對比例有所差異，與光譜圖結果一致（圖5C、D）。說明采用回收的TX-100進行紅曲霉重復萃取發酵可能改變了胞內的色素代謝調控水平，進而影響了胞內色素產量。分析第5次重復萃取發酵液中紅曲色素和TX-100的分離結果，發現利用THMS-Resin法同樣可以回收51.78%的黃色素和78.61%的TX-100。同時，分離過程中紅曲色素組分的HPLC譜圖與圖1基本一致，說明通過THMSResin法能很好地實現TX-100和紅曲色素的分離；回收的TX-100可以很好地重復用于萃取發酵，獲得較高含量的紅曲色素，尤其是黃色素。

3 結 論

采用THMS-Resin法可以分離出紅曲霉萃取發酵液中的TX-100和紅曲黃色素，回收率分別達到78%和52%左右；最終獲得的紅曲色素中含有大量的新黃色素成分，同時具有顯著的抗氧化活性。采用THMS-Resin法回收的TX-100進行紅曲霉重復萃取發酵，細胞生長良好，同時萃取劑保持較好的色素萃取性能，優于[BMIm]PF6和[BMIm]BF4法。采用新-舊TX-100進行協同萃取發酵，可以顯著促進胞內外色素代謝分泌；其中新-舊TX-100比例4∶1時，胞內外總色素產量提高最為明顯，達到35%左右。連續5 次采用回收的TX-100進行重復萃取發酵，紅曲霉生長穩定，細胞生長量高于正常萃取發酵水平；胞外色素相對含量均達到0.8以上，其中黃色素達到1.0；同時，胞內色素代謝能力能夠維持在相對含量0.6以上；另外，5 次重復萃取發酵TX-100回收率均達到80%左右。因此，THMS-Resin法能夠很好地實現萃取劑和紅曲色素的分離，回收的TX-100可以多次回用，為萃取發酵的生產應用提供參考。