枯草芽孢桿菌ZJS18發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸培養(yǎng)條件的優(yōu)化

于 平，黃星星，張一舒

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310035）

γ-聚谷氨酸是由L-谷氨酸和（或）D-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基之間的酰胺鍵連接而成[1]的一種水溶性、可生物降解和無毒性的生物高分子物質(zhì)[2-4]。γ-聚谷氨酸通常由上千個谷氨酸單體組成，分子質(zhì)量大約在1～200萬 Da之間[5]。不同菌種產(chǎn)生的γ-聚谷氨酸的分子質(zhì)量有所差異。γ-聚谷氨酸的特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有優(yōu)良的保水性能，在農(nóng)業(yè)上可用作保水劑[6]。此外，由于γ-聚谷氨酸的最終代謝產(chǎn)物為氨基酸，因此具有可生物降解、對人體無害無毒和無致免疫性的特點[7-8]，已被廣泛應(yīng)用于環(huán)保、化妝品、食品[9]和醫(yī)療等行業(yè)，成為理想的綠色材料。

γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法，微生物發(fā)酵法是目前最常用的方法之一。與其他方法相比，該法具有生產(chǎn)條件可工業(yè)化、生長周期相對較短、目標產(chǎn)物較易獲得以及產(chǎn)量高等優(yōu)點[10-12]。但目前我國通過微生物發(fā)酵法制備γ-聚谷氨酸存在生產(chǎn)成本高以及提取工藝復(fù)雜等缺點，難以實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用[13-14]，因此篩選優(yōu)良的生產(chǎn)菌株和優(yōu)化其發(fā)酵條件仍是我國目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸主要研究熱點之一。

在前期研究中，課題組從豆豉中篩選了一株能夠合成γ-聚谷氨酸的枯草芽孢桿菌ZJS18，該菌株能夠生產(chǎn)7.2 g/L的γ-聚谷氨酸。本研究擬通過響應(yīng)面法對篩選的枯草芽孢桿菌ZJS18發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，旨在進一步提高γ-聚谷氨酸產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，從而為其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用菌株為枯草芽孢桿菌ZJS18，由課題組從豆豉中篩選獲得，能夠生產(chǎn)γ-聚谷氨酸。

蔗糖、酵母粉、氯化鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、十六烷基三甲基溴化銨 生工生物工程（上海）有限公司；磷酸氫二鉀、硫酸鎂、谷氨酸鈉 英國BBI公司；γ-聚谷氨酸標準品 南京賽泰斯生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L。種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉5 g/L，谷氨酸鈉10 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.25 g/L?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖60 g/L，酵母粉8 g/L，谷氨酸鈉60 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

立式全自動高壓滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司；SKY-200B恒溫搖床 上海蘇坤實業(yè)有限公司；2K15型高速低溫離心機 德國Sigma公司；UV-320PC紫外分光光度計 英國Mapada公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；pH計 Mettler-Toledo儀器（上海）有限公司；Infinite M200多功能酶標儀美國Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將200 μL甘油管保存的菌液接種于裝有10 mL LB培養(yǎng)基的試管中，200 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。按2%（體積分數(shù)，下同）的接種量將新鮮培養(yǎng)液接種于裝有40 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，200 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，制備種子培養(yǎng)液。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液以5%的接種量接種于裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng)，37 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)36 h。

1.3.3 Plackett-Burman試驗設(shè)計

在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對γ-聚谷氨酸產(chǎn)量影響較大的10 個因素，利用Design Expert 8.0軟件對其進行N為12的Plackett-Burman試驗設(shè)計，每個因素選高低2 個水平，以（-1，1）編碼各值，以γ-聚谷氨酸產(chǎn)量作為響應(yīng)值。每組試驗設(shè)置3 個平行以減少試驗誤差[15]。Plackett-Burman試驗設(shè)計的因素和水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and their coded values used for Plackett-Burman design

1.3.4 最陡爬坡試驗確定響應(yīng)面因素水平的中心點

根據(jù)表1試驗數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，可以從眾多影響因素中篩選出3 個影響γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的最顯著因素，以此確定各因素的水平，表現(xiàn)為正效應(yīng)的因素取高水平、負效應(yīng)的因素取低水平。根據(jù)這3 個因素效應(yīng)的大小設(shè)定變化的方向和步長，進行試驗設(shè)計確定響應(yīng)面分析的中心點。

1.3.5 Box-Behnken試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗分析結(jié)果和最陡爬坡試驗確定的3 個顯著影響因素用量的取值區(qū)間，進一步設(shè)計3因素3水平共17 個試驗點的Box-Behnken響應(yīng)面試驗，其中12 個點是析因點，5 個點是中心復(fù)合點[16]。以3 個顯著影響因素為響應(yīng)面設(shè)計自變量，以γ-聚谷氨酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，每個因素的3 個水平以（-1，0，1）編碼，每個試驗點進行3 次平行減小試驗誤差[17-18]。其他因素的高低水平根據(jù)Plackett-Burman試驗分析結(jié)果確定，表現(xiàn)為正效應(yīng)的因素取高水平、負效應(yīng)的因素取低水平。Box-Behnken試驗設(shè)計的因素及水平如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計的因素與水平Table 2 Factors and their coded values used for Box-Behnken design

1.3.6 搖瓶發(fā)酵實驗

將200 μL甘油管保存的枯草芽孢桿菌ZJS18菌種接種于裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h后，以2%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有40 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)10 h。按5%的接種量將種子液接種到裝有500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1 L搖瓶中，于37 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔4 h取樣測定發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。

1.3.7 γ-聚谷氨酸標準曲線的制作

γ-聚谷氨酸與十六烷基三甲基溴化銨-NaOH溶液反應(yīng)會形成混懸液。配制2%的NaOH溶液，并以此為溶劑，加入十六烷基三甲基溴化銨，配制成5 g/L的十六烷基三甲基溴化銨溶液。

精確稱取γ-聚谷氨酸，配制成8、16、24、32、40 μg/mL和48 μg/mL的γ-聚谷氨酸標準液，加入等體積的十六烷基三甲基溴化銨溶液，反應(yīng)3 min后，用分光光度計測定反應(yīng)液在250 nm波長處吸光度，繪制γ-聚谷氨酸的標準曲線[17-18]。

1.3.8 發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的測定

取1 mL發(fā)酵液，4 ℃、4 800 r/min離心25 min。取上清液250 μL，加入3 倍體積的無水乙醇，搖勻后4 ℃靜置過夜，然后于8 000 r/min離心15 min。取沉淀，加入與發(fā)酵液等體積的蒸餾水溶解，即為樣液。將樣液稀釋適當倍數(shù)后，測定其在250 nm波長處的吸光度[13]。將吸光度代入γ-聚谷氨酸標準曲線，得到相應(yīng)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量，再乘以稀釋倍數(shù)，即發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Plackett-Burman試驗設(shè)計、最陡爬坡試驗設(shè)計以及Box-Behnken試驗設(shè)計均采用Design Expert 8.0軟件，數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010軟件，數(shù)據(jù)作圖采用Origin 8.5.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-聚谷氨酸標準溶液曲線

以γ-聚谷氨酸標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度（A250nm）為縱坐標，繪制γ-聚谷氨酸的標準曲線。對標準曲線進行回歸模擬，得到方程：y=21.187 5x+0.001 1，R2＝0.999 2，該標準曲線線性關(guān)系良好。

2.2 Plackett-Burman試驗結(jié)果

根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果，選取10 個對γ-聚谷氨酸產(chǎn)量影響較大的因素，通過Design Expert 8.0軟件進行N為12的Plackett-Burman試驗設(shè)計，試驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計和結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design with experimental results

利用Design Expert 8.0軟件對表3試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果如表4所示。

表4 Plackett-Burman 試驗設(shè)計方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for the Plackett-Burman design

由表4可知，試驗?zāi)Ｐ偷腜值小于0.05，表明該模型影響顯著。蔗糖用量、酵母粉用量和谷氨酸鈉用量3 個因素通過F檢驗后所得的P值均小于0.05，說明它們對γ-聚谷氨酸產(chǎn)量有顯著影響，其中蔗糖用量的影響最為顯著，因此選取這3 個因素為顯著影響因素。此外，從表4還可以看出，酵母粉用量對γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響呈現(xiàn)負效應(yīng)，而蔗糖用量和谷氨酸鈉用量的影響呈現(xiàn)正效應(yīng)。

2.3 最陡爬坡試驗結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果分析，確定蔗糖用量、谷氨酸鈉用量和酵母粉用量3 個因素為影響γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的顯著性因素。根據(jù)這3 個因素效應(yīng)的大小設(shè)定變化的方向及步長，進行最陡爬坡試驗，確定中心點。最陡爬坡的試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Steepest ascent design with experimental results

由表5可知，隨著蔗糖、谷氨酸鈉和酵母粉用量的變化，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當蔗糖、谷氨酸鈉和酵母粉用量分別為60、60 g/L和8 g/L時，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量最大，因此選擇這3 個因素質(zhì)量濃度為中心點，進行響應(yīng)面分析。

2.4 Box-Behnken試驗結(jié)果

通過Plackett-Burman試驗篩選出了蔗糖、酵母粉和谷氨酸鈉用量3 個主要影響因素，然后通過最陡爬坡試驗確定主要影響因素的具體質(zhì)量濃度的取值區(qū)間。以蔗糖、酵母粉和谷氨酸鈉用量3 個顯著影響因素作為響應(yīng)面設(shè)計的自變量，以γ-聚谷氨酸產(chǎn)量作為響應(yīng)值進行Box-Behnken試驗，結(jié)果如表6所示。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Box-Behnken design with experimental results

利用Design Expert 8.0軟件對表6數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果如表7所示，回歸模型的方差分析如表8所示。

表7 Box-Behnken試驗結(jié)果分析Table 7 Analysis of the experimental results of Box-Behnken design

表8 回歸模型的方差分析Table 8 Analysis of variance for regression model

由表7、8可知，回歸模型的R2值為0.985 7，F(xiàn)值為53.71，顯著性水平P值小于0.000 1，說明該試驗?zāi)Ｐ偷淖宰兞亢鸵蜃兞恐g的函數(shù)關(guān)系顯著，在P值為0.05的水平上足夠擬合試驗數(shù)據(jù)。失擬項的F值為9.40（P值0.027 7＞0.01），說明失擬項不顯著，即回歸模型顯著，該試驗?zāi)Ｐ涂尚哦雀?，可用來分析及預(yù)測最大值。校正系數(shù)為0.967 4，說明該模型能夠解釋96.74%的γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的變化，模型擬合度好。

由表8可知，蔗糖、谷氨酸鈉和酵母粉用量的P值均小于0.05，說明這3 個因素對γ-聚谷氨酸產(chǎn)量影響的線性效應(yīng)顯著，其中蔗糖用量的影響最為顯著。AB、BC的P值也小于0.05，說明蔗糖和谷氨酸鈉用量以及谷氨酸鈉和酵母粉用量之間的交互作用顯著。應(yīng)用Design Expert 8.0軟件對表6中的試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，得到回歸方程：Y=13.06+0.62A+0.31B-0.39C-0.84AB-0.067AC+0.92BC-0.93A2-1.15B2-0.67C2。

2.5 最佳條件的確定及驗證實驗結(jié)果

根據(jù)二次回歸方程可以得到相應(yīng)的響應(yīng)面圖以及等高線圖，如圖1所示。

響應(yīng)面的等高線圖可直觀地反映出各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，以便找出最佳工藝參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用。如果等高線的形狀是橢圓形，表示兩因素的交互作用顯著，而越接近圓形則表示不顯著[19-20]；并且在一條線上，所有的試驗方案都可以得到相同的數(shù)值。響應(yīng)面三維立體圖能夠反映出各因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響，坡度越陡，影響越顯著[21-22]。

圖1 任意兩因素對聚谷氨酸產(chǎn)量交互影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig. 1 Response surface plot and contour plot showing the interactive effects of various factors on the production of poly γ-glutamic acid

由圖1可知，谷氨酸鈉用量與酵母粉用量對γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的交互作用最為顯著，蔗糖與谷氨酸鈉用量對γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的交互作用顯著，蔗糖用量與酵母粉用量的交互作用不顯著。在一定范圍內(nèi)，隨著蔗糖用量、谷氨酸鈉用量和酵母粉用量的增加，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量隨之增加。當達到最大值后，隨著各因素用量的繼續(xù)增加，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量逐漸減小。說明只有在各因素用量適宜的條件下，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量才會達到最大值。響應(yīng)面圖顯示了兩個因素之間存在著交互作用，說明它們之間對γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響并不是簡單的線性關(guān)系，而是存在交互作用，共同影響著γ-聚谷氨酸的生物合成。

基于上述模型，通過Design Expert 8.0 軟件對回歸方程求極值，由二次多項回歸方程得出3 個因素的最佳值為谷氨酸鈉用量57.96 g/L、蔗糖用量64.40 g/L和酵母粉用量7.10 g/L。在上述條件下，預(yù)測的γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的最大值為13.25 g/L。在最佳培養(yǎng)條件下進行3 次平行實驗，獲得的γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的平均值為13.20 g/L，與理論預(yù)測值接近，說明該模型能較好地反映枯草芽孢桿菌ZJS18發(fā)酵合成γ-聚谷氨酸的實際情況。

2.6 1 L搖瓶發(fā)酵過程曲線

圖2 1 L搖瓶中γ-聚谷氨酸發(fā)酵過程分析Fig. 2 Time-course analysis of γ-PGA fermentation in a 1-L shake fl ask

由圖2可以看出，菌株在0～8 h時處于延遲期；8～20 h處于對數(shù)生長期，由OD600nm表示的菌體生長量由0.87快速增加到3.24，發(fā)酵液中的γ-聚谷氨酸也在這個階段大量積累，從0.31 g/L增加到6.98 g/L；20～32 h菌體處于穩(wěn)定生長期，但發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸產(chǎn)量仍在迅速積累，從6.98 g/L增加到14.12 g/L；之后菌體生長進入衰亡期，菌體量下降，但γ-聚谷氨酸的積累仍在進行。由發(fā)酵過程的參數(shù)變化還可以看出，枯草芽孢桿菌ZJS18在菌體生長進入對數(shù)期后，其合成γ-聚谷氨酸的速率增加較快，且與細胞生長呈現(xiàn)相關(guān)性。

3 討 論

通過以上研究結(jié)果可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著蔗糖和谷氨酸鈉用量的增加，能夠取得較高的γ-聚谷氨酸產(chǎn)量，說明蔗糖和谷氨酸鈉用量對γ-聚谷氨酸的影響呈現(xiàn)正效應(yīng)，也說明碳源和前體物質(zhì)相互影響，促進菌體合成γ-聚谷氨酸；但當兩者用量增加到一定數(shù)值后，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量開始降低。當谷氨酸鈉用量不變時，隨著蔗糖用量的增加，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量也隨之增加；但隨著酵母粉用量的變化，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量變化較小，這可能是因為酵母粉對γ-聚谷氨酸的合成呈現(xiàn)負效應(yīng)。上述結(jié)果說明碳源和氮源雖然都能影響γ-聚谷氨酸的生物合成，但兩者之間并沒有太大的交互影響。隨著谷氨酸鈉用量的增加和酵母粉用量的減小，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量增加，說明前體物和氮源之間存在交互作用，共同影響著γ-聚谷氨酸的生物合成。

與已報道的文獻[23-25]相比，本研究發(fā)現(xiàn)γ-聚谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)碳源是蔗糖，而不是葡萄糖，其中的原因可能是因為葡萄糖效應(yīng)的產(chǎn)生，使得細菌對葡萄糖攝取的生物能轉(zhuǎn)換受到了限制，細菌生長也因此受到抑制。本實驗篩選的枯草芽孢桿菌ZJS18在發(fā)酵36 h時，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量達到最高值，為16.9 g/L。文獻報道的其他高產(chǎn)γ-聚谷氨酸的菌株，如枯草芽孢桿菌RKY3[26]、地衣芽孢桿菌ATCC9945[27-28]和地衣芽孢桿菌NCIM 2324[29]等，其γ-聚谷氨酸產(chǎn)量為15～20 g/L，但培養(yǎng)時間為72～96 h，時間較長。另外，現(xiàn)在大部分報道的提高產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)量的方法是通過菌種誘變[30-31]，但該法具有不確定性，且費時費力。隨著分子生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展，如果想從根本上大量生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，必須深入探究其生物合成途徑，因此下一步擬研究枯草芽孢桿菌ZJS18合成γ-聚谷氨酸的生物合成途徑，并通過代謝工程的方法對其進行改造，進一步提高γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。

4 結(jié) 論

本實驗主要研究了枯草芽孢桿菌ZJS18發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的最優(yōu)培養(yǎng)條件。通過Plackett-Burman試驗設(shè)計，篩選出蔗糖、酵母粉和谷氨酸鈉用量3 個因素對γ-聚谷氨酸產(chǎn)量具有顯著影響的因素，并通過最陡爬坡試驗進一步確定了它們的取值范圍，最后通過Box-Behnken試驗進行響應(yīng)面設(shè)計，確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方：谷氨酸鈉用量57.96 g/L、蔗糖用量64.40 g/L、酵母粉用量7.1 g/L、氯化鈉用量30 g/L、MgSO4用量0.3 g/L、K2HPO4用量2 g/L；最佳發(fā)酵條件：接種量5%、裝液量40 mL/250 mL、溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、培養(yǎng)時間36 h。在上述條件下，γ-聚谷氨酸產(chǎn)量為13.20 g/L。與原始發(fā)酵條件相比，產(chǎn)量提高了1.88 倍。