驢皮膠及鹿皮膠的化學品質分析與評價

張 磊，王燕華，劉 暢，宮瑞澤，李珊珊，孫印石*

（中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112）

驢皮膠（阿膠）作為我國傳統中藥，利用馬科動物驢（Equus asinus L.）的皮經煎煮熬制、濃縮干燥而成的固體膠塊[1]。驢皮膠的滋陰補血、提高免疫等功效已被現代研究所證實[2-5]。鹿皮膠是以鹿科動物梅花鹿（Cervus nipport T.）或馬鹿（Cervus elaphus L.）的皮為原料經過蒸煮、濃縮、干燥而得，具有補血益氣、補腎壯陽等功能[6-8]。研究發現驢皮膠及鹿皮膠中均含有大量蛋白質、氨基酸、脂類、糖類、核酸及微量元素等有效成分[9-10]，多種成分聯合構成二者藥理活性的物質基礎。

現在對于驢皮膠的質量評價主要依據2015版《中華人民共和國藥典》[1]，以水分、重金屬、水不溶物及4 種氨基酸含量為評價標準。目前市場上以鹿膠糕及鹿膠粉為主的鹿皮膠系列產品已經上市，但其相應的評價標準還不完善。鑒于此，本研究根據《藥典》[1]檢測指標對東阿驢皮膠及自制鹿皮膠中水分、重金屬、水不溶物及氨基酸含量進行測定與分析，同時還分別采用超高效液相色譜（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）及毛細管氣相色譜法對兩種膠類中核苷成分及脂肪酸含量與組成進行檢測與比較分析，為膠類制品的質量評價提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

驢皮膠（批號：1510016、1606029、1608049）山東東阿阿膠股份有限公司；鹿皮膠（編號：160525、160701、170311） 自制。

硝酸、鹽酸、硼氫化鉀、氫氧化鉀（均為優級純）北京化學試劑研究所；超純水（電阻率≥18.2 Ω），Cu、Cd、Pb、As、Hg的單元素標準儲備液（質量濃度均為1 000 μg/mL） 國家標準物質研究中心；H型氨基酸混合標準溶液 日本Wako公司；核苷對照品：尿嘧啶（LOT：TM0313XB13）、胞嘧啶（LOT：TN1128XA13）、腺嘌呤（LOT：X18N6M6005）、鳥嘌呤（LOT：KM0522CA14）、次黃嘌呤（LOT：TM0313XC13）、黃嘌呤（LOT：AJ0722MA14）、尿苷（LOT：TM0313XA13）、胸腺嘧啶（LOT：140708-200401）、肌苷（LOT：TJ0623XA13）、鳥苷（LOT：AJ0609NA14）、腺苷（LOT：KM0529CA14）、2’-脫氧鳥苷（LOT：N07A7W12580）、β-胸苷（LOT：DN1122WB13）（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；37 種脂肪酸甲酯混合標準品（10 mg/mL）上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇、乙腈、正己烷（均為色譜純） 美國Fisher公司；三氯甲烷、冰乙酸（均為分析純） 北京翰天科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A型氣相色譜儀 美國Agilent公司；ACQUITY UPLC H-Class UPLC儀 美國Waters公司；MS-204S型精密電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；DHS16-A多功能紅外水分測定儀 上海精密科學儀器有限公司；MSW-4微波消解儀 德國Berghof公司；NexION 350X電感耦合等離子體質譜儀 美國Perkin Elmer公司；ZEEnit700原子吸收光譜儀 德國Jena公司；PF6-3原子熒光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；WP-UP-WF-40微量分析型超純水機 四川沃特爾水處理設備有限公司；JP-100ST超聲波清洗機深圳潔盟清洗設備有限公司；L-8900型氨基酸自動分析儀日本日立公司；SF-TGL-16M臺式離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；EX125DZH電子天平 奧豪斯儀器有限公司；多樣品平行蒸發儀 瑞士Büchi公司；HGC-36A干式氮吹儀 天津恒奧科技發展有限公司；DB-23氣相毛細管色譜柱 美國Superco公司。

1.3 方法

1.3.1 鹿皮膠的制作

稱取適量新鮮鹿皮，經清洗、浸泡、熬汁、除雜、過濾、凝膠、干燥、整形而制得鹿皮膠。

1.3.2 水分含量測定

稱取驢皮膠（鹿皮膠）粉末樣品5 g，平鋪于水分測定儀的秤盤上，設置溫度100 ℃，時間20 min，待加熱停止，讀數，每個樣品重復3 次。

1.3.3 重金屬元素含量測定

1.3.3.1 標準曲線繪制

將Pb、Cd、As、Hg、Cu標準溶液稀釋至10 μg/L，置于100 mL容量瓶，2% HNO3溶液定容，搖勻，備用，上機自動質量濃度梯度稀釋繪制標準曲線。各元素線性回歸方程見表1。

表1 元素線性回歸方程Table 1 Linear regression equations for heavy metal elements

1.3.3.2 樣品制備

精密稱取驢皮膠（鹿皮膠）粉末樣品0.30 g，置于消解罐中，加入5 mL濃HNO3，參照文獻[11]設定消解程序，進行微波消解，將消解液轉移至100 mL容量瓶，超純水洗滌并定容，搖勻，備用。以同法制備空白溶液。

1.3.3.3 樣品測定

利用質譜調諧液調諧儀器，參照文獻[11]設置儀器工作參數，依次測試標準液及樣品溶液。

1.3.4 水不溶物的測定

精密稱取驢皮膠（鹿皮膠）粉末樣品1.00 g，置于10 mL具塞離心管中，加水5 mL，加熱溶解，以5 mL溫水洗滌3 次，洗液并入離心管中，將離心管置于40 ℃水浴保溫15 min，室溫2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入5 mL溫水洗滌3 次，棄上清液，離心管于105 ℃加熱2 h，取出冷卻30 min，精密稱定。

1.3.5 氨基酸含量的測定

1.3.5.1 標準曲線繪制

將氨基酸標準混合液用0.1 mol/L HCl溶液稀釋1 000 倍，取適量注入氨基酸自動分析儀測試。

1.3.5.2 樣品前處理

精密稱取驢皮膠（鹿皮膠）粉末樣品0.10 g置于50 mL氨基酸水解管中，加入6 mol/L的鹽酸溶液20 mL，超聲10 min，充氮，密封，置于110 ℃恒溫干燥箱中水解22 h，結束后取出冷卻至室溫，定容，取800 μL置于10 mL試管中，于70 ℃真空干燥箱中烘干，加入0.02 mol/L的鹽酸溶液2 mL，渦旋混勻，過0.22 μm孔徑水系微孔濾膜后上機待測。

1.3.5.3 樣品測定

取氨基酸標準混合液與制備好的樣品各20 μL注入氨基酸自動分析儀進行測定。采用茚三酮進行柱后衍生，色譜條件：HITACHI 2622SC-PH離子分離柱（4.6 mm×60 mm），日立專用3 μm磺酸型陽離子交換樹脂，柱溫57 ℃，反應單元溫度135 ℃；泵1流速0.4 mL/min，泵壓力0.3～25 MPa，泵2流速0.35 mL/min，泵壓力0～0.2 MPa；檢測波長：1通道570 nm，2通道440 nm；進樣體積20 μL；分析時間：1通道32 min，2通道10 min。

1.3.6 核苷含量的測定

1.3.6.1 標準溶液配制

精密稱取胞嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、肌苷、鳥苷、腺苷、2’-脫氧鳥苷、β-胸苷13 種對照品各5 mg，分別置于10 mL容量瓶，鳥嘌呤、黃嘌呤加0.1%氫氧化鉀溶液，其他對照品加水定容。取各標準品溶液2 mL于50 mL容量瓶，配制成混合標準品母液。分別取混合標準品母液1、2、3、4、5、6、8 mL于10 mL容量瓶，定容，配制成2、4、6、8、10、12、16 μg/mL的對照品溶液。

1.3.6.2 樣品制備

精密稱取驢皮膠（鹿皮膠）粉末樣品0.10 g，置于4 mL離心管中，加入3 mL蒸餾水，稱量，室溫下超聲提取60 min，冷卻至室溫，稱量，加水補足損失的質量，混勻并于13 000 r/min離心10 min，取上清液以0.22 μm濾膜濾過，即為待測品。

1.3.6.3 色譜條件

色譜柱：A C Q U I T Y U P L C?H S S T 3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：以乙腈為流動相A，0.01%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫：0～1 min，0% A；1～8 min，0%～8% A；8～9 min，8%～15% A；9～10.5 min，15% A；10.5～11 min，15%～0% A；11～15 min，0% A；流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：260 nm；進樣量：3 μL。

1.3.6.4 樣品測定

分別吸取對照標準品與待測樣品各3 μL注入UPLC儀測定，每份樣品平行測定3 次，取平均值，獲得13 種對照標準品的色譜峰峰面積，以外標法計算供試樣品中核苷類成分含量。

1.3.7 脂肪酸含量的測定

1.3.7.1 標準溶液配制

準確稱取脂肪酸甲酯混合標準品200 μL置于樣品瓶中，加入正己烷定容至1 mL，上機備用。

1.3.7.2 樣品甲酯化

精密稱取驢皮膠（鹿皮膠）粉末樣品1.00 g，置于50 mL具塞水解管中，加入10 mL 1%的氫氧化鉀-甲醇溶液，振蕩混勻后于室溫下靜置1 h，依次加入0.5～1 mL 10%乙酸溶液及5 mL正己烷，搖勻后靜置分層過夜，將上層有機相轉移至新試管，以氮氣吹干，加入正己烷定容至2 mL，以0.22 μm濾膜過濾后供氣相色譜分析。

1.3.7.3 色譜條件

色譜柱：DB-23毛細管氣相色譜柱（100 m×0.25 mm，0.15 μm）；載氣：高純氮氣，流速：0.5 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；進樣量：1 μL；分流比：40∶1；程序升溫：初始溫度50 ℃，保持1 min，以25 ℃/min升溫到175 ℃后以3 ℃/min升溫到230 ℃，保持8 min；檢測器：氫火焰離子化檢測器；檢測器溫度：280 ℃。

1.3.7.4 樣品測定

分別吸取對照標準品與待測樣品各1 μL注入氣相色譜儀測定，每份樣品平行測定3 次，取平均值。采用保留時間對比法對脂肪酸混合標準品進行定性分析，待測樣品譜圖與標準譜圖相似度不小于95%時確定為該種化合物。脂肪酸定量分析采用面積歸一法，根據峰面積計算各種脂肪酸的相對含量。

1.4 數據處理

所有數據采用GraphPad Prism 6軟件處理，應用獨立t檢驗對數據進行顯著性分析。所有數據以表示。

2 結果與分析

2.1 水分含量結果

經測定，驢皮膠與鹿皮膠在100 ℃、加熱20 min時的水分質量分數分別為12.77%及14.22%，鹿皮膠中水分含量略高于驢皮膠（P＜0.05）。

2.2 重金屬元素含量結果

表2 驢皮膠及鹿皮膠中重金屬含量Table 2 Heavy metal contents in donkey hide gelatin and deer skin gelatin mg/kg

如表2可知，驢皮膠及鹿皮膠中的重金屬元素含量普遍很低，其中Pb含量較高，在二者中的含量分別達到1.01、1.33 mg/kg；Cu含量也相對較高（0.8 mg/kg），其他重金屬元素含量較低，均未大于0.1 mg/kg。

2.3 水不溶物含量

經測定計算，驢皮膠及鹿皮膠中的水不溶物質量分數分別為（1.80±0.25）%及（1.60±0.80）%，二者差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 氨基酸含量測定結果

表3 驢皮膠與鹿皮膠中氨基酸成分含量及相對含量Table 3 Amino acid compositions of donkey hide gelatin and deer skin gelatin

氨基酸種類及含量是評定蛋白質營養價值的重要指標[12]。本研究中，驢皮膠與鹿皮膠中氨基酸質量分數分別為85.66%及90.02%（表3），鹿皮膠中氨基酸總量略高于驢皮膠（P＜0.05）；所有氨基酸組分中，以甘氨酸（Gly）含量最高，其在兩種膠中質量分數均達到21.00%以上，占氨基酸總含量的25%，Gly已被證明可在氧化應激[13]、細胞損傷[14]及藥物中毒[15]方面均有保護作用，近年來的研究發現Gly還具有抗炎及免疫調節作用[16]；所有氨基酸中含量最低的為半胱氨酸（Cys），其質量分數只有0.10%，占氨基酸總含量的0.13%；鹿皮膠中精氨酸（Arg）及脯氨酸（Pro）含量極顯著高于驢皮膠中的含量（P＜0.01）；驢皮膠中Val的含量極顯著高于鹿皮膠（P＜0.01）。驢皮膠與鹿皮膠中必需氨基酸質量分數分別為16.14%及15.89%。此外，Glu、Ala、Pro在兩種膠中的相對含量均超過10%。Glu是腦中含量最多的氨基酸，作為神經遞質參與學習及睡眠等行為[17]；Ala可參與葡萄糖誘導的動物體內胰島素分泌的生理調節[18]；Pro被報道與組織生長、機體免疫及體內多胺合成密切相關[19]。綜上可見，驢皮膠及鹿皮膠可利用氨基酸開發營養調節劑。

2.5 核苷含量測定結果

表4 驢皮膠與鹿皮膠中核苷成分含量及百分比Table 4 Nucleosides compositions of donkey hide gelatin and deer skin gelatin

核苷參與細胞信號轉導及生物酶的調控等生物反應，核苷及其衍生物具有多種生物活性[20]，常被用于藥物開發。驢皮膠與鹿皮膠核苷成分含量測定結果見表4。驢皮膠中總核苷含量達到191.42 μg/g，各成分的含量分布在0.93～35.46 μg/g之間，含量最高的核苷為黃嘌呤，含量占總核苷含量的18.52%；含量最低的為肌苷，只占0.49%；鹿皮膠中總核苷含量達到284.69 μg/g，各成分的含量分布在0.28～70.44 μg/g之間，含量最高的核苷為次黃嘌呤，含量達到總含量的24.68%；含量最低的為2’-脫氧鳥苷，只占0.10%。驢皮膠中的腺嘌呤、β-胸苷、鳥苷及尿苷含量均高于鹿皮膠中的含量（P＜0.001）；而鹿皮膠中的尿嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、胸腺嘧啶及核苷總含量均高于驢皮膠中的含量（P＜0.001）。研究發現，次黃嘌呤作為重要的生物堿嘌呤，對心血管疾病作用顯著[21]；此外，次黃嘌呤及黃嘌呤均被證實具有舒張氣管、平喘等藥理作用[22]，尿嘧啶可抑制5-氟尿嘧啶的分解，后者在抗癌抗腫瘤方面應用廣泛[23]。本研究發現鹿皮膠中尿嘧啶、次黃嘌呤及黃嘌呤含量均較高且高度顯著高于驢皮膠中含量，說明鹿皮膠具有可以用于開發此類藥物的前景。在鹿皮膠中未檢測到胞嘧啶、肌苷及β-胸苷3 種成分，可能是由于鹿體內特殊代謝或原料加工過程中損失所致，還有待于更進一步的研究。

2.6 脂肪酸的含量測定

2.6.1 脂肪酸含量及組成

由表5可知，驢皮膠中共含有21 種脂肪酸，其中飽和脂肪酸9 種，占總脂肪酸含量的26.52%；單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸各含6 種，分別占總脂肪酸含量的33.36%及40.14%；鹿皮膠中脂肪酸共含有22 種，其中飽和脂肪酸9 種，占總脂肪酸含量的36.29%；單不飽和脂肪酸6 種及多不飽和脂肪酸7 種，分別占總脂肪酸含量的38.64%及25.08%。

表5 驢皮膠與鹿皮膠中脂肪酸含量及百分比Table 5 Fatty acids compositions of donkey hide gelatin and deer skin gelatin

續表5

2.6.2 飽和脂肪酸比較

由表5可知，在飽和脂肪酸中，棕櫚酸（C16:0）含量最高，其在驢皮膠及鹿皮膠中的占比分別達到19.03%及24.64%，鹿皮膠中的含量顯著高于驢皮膠（P＜0.05）；月桂酸（C12:0）含量最低，其在兩種膠中均只占0.10%左右（表5）。鹿皮膠中的肉豆蔻酸（C14:0）及十五碳酸（C15:0）的含量均極顯著高于驢皮膠（P＜0.01）；鹿皮膠中硬脂酸（C18:0）含量略高于驢皮膠，但差異不顯著（P＞0.05）（圖1）。動物類油脂中的飽和脂肪酸主要以棕櫚酸及硬脂酸為主，二者均能降低血清中膽固醇的含量[24]。本研究發現鹿皮膠中棕櫚酸及硬脂酸的含量均高于驢皮膠，說明鹿皮膠具備更好的防治高膽固醇血癥的作用。

2.6.3 不飽和脂肪酸比較

單不飽和脂肪酸中以油酸（C18:1,cis-9）含量最高，其在驢皮膠及鹿皮膠中的占比分別達到28.01%及20.68%；順-10-十七碳烯酸（C17:1,cis-10）及順-11-二十碳烯酸（C20:1,cis-11）含量最低，它們在兩種膠中的占比只有0.3%左右（表5）。鹿皮膠中順-9-肉豆蔻烯酸（C14:1,cis-9）及棕櫚油酸（C16:1,cis-9）的含量均高度顯著高于驢皮膠（P＜0.001）（圖1）。

多不飽和脂肪酸中含量最高的是亞油酸（C18:2,cis-9,12），驢皮膠中的占比達到31.59%，顯著高于鹿皮膠中的21.21%（P＜0.05）；順-11,14-二十碳二烯酸（C20:2,cis-11,14）含量最低，其在兩種膠中占比只有0.20%左右；花生四烯酸（C20:4,cis-5,8,11,14）只在鹿皮膠中檢測到，其占比達到0.21%；證明驢皮膠中并不含有花生四烯酸，這與胡晶紅等[25]的研究結果相一致；驢皮膠中α-亞麻酸（C18:3,cis-9,12,15）的含量也相對較高，明顯高于鹿皮膠（P＜0.01）（圖1）。

圖1 驢皮膠與鹿皮膠中主要單一脂肪酸含量比較（相對含量≥1%）Fig. 1 Comparison of mono fatty acid contents in donkey hide gelatin and deer skin gelatin

2.6.4 各類脂肪酸總量比較

圖2 驢皮膠與鹿皮膠中脂肪酸總量比較Fig. 2 Comparison of total fatty acid contents in donkey hide gelatin and deer skin gelatin

由圖2可知，鹿皮膠中總脂肪酸含量（（12 895.50±1 167.12）mg/kg）高于驢皮膠中的含量（（11 695.83±1 607.74）mg/kg），但差異并不顯著（P＞0.05）；鹿皮膠中的飽和脂肪酸含量（（4 690.38±490.53）mg/kg）及單不飽和脂肪酸含量（（5 039.13±526.02）mg/kg）均高于驢皮膠，而驢皮膠中多不飽和脂肪酸含量（（4 717.95±651.93）mg/kg）、必需脂肪酸及n-6型不飽和脂肪酸含量均顯著高于鹿皮膠（P＜0.05），而n-3型不飽和脂肪酸含量極顯著高于鹿皮膠（P＜0.01）。

人體內必需脂肪酸包括亞油酸及α-亞麻酸，二者不能由人體自身合成，必需從食物中獲得[26]。本研究中發現驢皮膠中的必需脂肪酸明顯高于鹿皮膠，且亞油酸及α-亞麻酸含量均高于鹿皮膠，證明驢皮膠中必需脂肪酸的比例更有助于營養平衡。

食品中的脂肪酸比例組成對于人體健康至關重要，關于飽和脂肪酸/單不飽和脂肪酸/多不飽和脂肪酸的比例，不同國家的推薦比例通常為1∶1∶1、1∶1.5∶1、1∶4∶1及3∶4∶3等[27-28]，中國營養學會推薦比例為1∶1∶1[29]。本研究中發現驢皮膠中飽和脂肪酸/單不飽和脂肪酸/多不飽和脂肪酸的比例為1∶1.2∶1.5，鹿皮膠中三者的比例為1.5∶1.6∶1，二者的比例均接近于推薦的健康比例。

n-6及n-3型多不飽和脂肪酸的含量及組成對于人體健康具有重要影響[30]，高比例的n-6/n-3可以導致冠心病、癌癥、炎癥及自身免疫缺陷等多種疾病的發生[31-34]。世界衛生組織推薦n-6/n-3的比例為6∶1[35]，中國營養學會推薦二者比例為4∶1～6∶1[29]。本研究結果表明，驢皮膠中n-6/n-3的比例為5.26∶1，而鹿皮膠中n-6/n-3的比例達到9.55∶1，可見驢皮膠中不飽和脂肪酸的組成比例更接近于營養學會推薦比例。

3 結 論

本研究中檢測所得驢皮膠及鹿皮膠中水分、重金屬、水不溶物及氨基酸含量均達到《藥典》[1]規定水平，證明鹿皮膠同驢皮膠一樣具有產品深加工的潛力。驢皮膠及鹿皮膠均含有較多的Gly、Glu、Ala、Pro，對于調控人體內多種生理功能方面發揮重要作用。鹿皮膠中具有藥理功能的有益核苷較多，可進一步研究其有效成分為新藥開發提供依據。鹿皮膠在有益飽和脂肪酸含量方面優于驢皮膠，而后者在必需脂肪酸及多不飽和脂肪酸含量及組成方面更有優勢，二者在飽和脂肪酸/單不飽和脂肪酸/多不飽和脂肪酸的比例上均接近于推薦的健康比例。