熱處理對大豆11S球蛋白溶解性和二級結構的影響

齊寶坤，趙城彬，李 楊，徐 靚，丁 儉，王 歡，江連洲,*

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

溶解性是大豆蛋白最重要的功能特性之一，它是大豆蛋白其他功能特性的基礎，是大豆蛋白可應用性的重要參數。一般來說，蛋白質具有良好的功能特性，前提是必須有較高的溶解性，蛋白質的凝膠性、乳化性等其他功能特性都與蛋白質的溶解性密切相關[1]。在大豆蛋白食品生產加工過程中都包括熱處理過程，如熱殺菌、噴霧干燥等，這些操作都會對大豆蛋白的溶解性、乳化性、穩定性等功能性質產生較大的影響[2]。在食品生產加工過程中，溫度較低或熱處理時間較短時大豆蛋白的結構不會發生改變，使大豆蛋白表現出的功能特性不理想，但過高溫度或過長時間的熱處理又會使大豆蛋白過度變性和蛋白質分子發生聚集，使其失去大部分固有的功能性質[3]。熱處理的溫度和時間等因素對蛋白質的聚集程度具有重要影響，可以通過調整熱處理條件控制蛋白質的溶解、聚集狀態，從而控制蛋白質的功能性質[4]。大豆分離蛋白主要是由β-伴大豆球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）組成，由于11S球蛋白具有緊密的分子結構，多數活性基團被包裹在球狀結構的內部，這是限制大豆蛋白在食品中應用的關鍵因素[5]。因此，研究大豆11S球蛋白對改善大豆分離蛋白功能性質及拓展其應用具有重要意義[6-8]。目前已有較多研究以大豆分離蛋白、大豆7S球蛋白和11S球蛋白為對象，探討熱處理過程中蛋白質的結構變化及聚集行為。Weijers等[9]研究指出蛋白質的變性和聚集程度會對大豆蛋白的功能性質產生顯著影響。Chen Nannan等[10]對中性條件下，50～95 ℃形成的大豆11S球蛋白熱聚集體進行研究，發現聚集體的粒徑隨著熱處理時間的延長而增大，而且在這種熱處理條件下均能形成熱凝膠。本實驗對大豆11S球蛋白的溶解性和紅外光譜進行分析，探討熱處理對大豆11S球蛋白溶解性和二級結構的影響，為功能性大豆食品開發和品質控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（東農46） 東北農業大學大豆研究所；Lowry法蛋白質含量測定試劑盒 上海荔達生物科技有限公司；牛血清白蛋白 美國Sigma公司；溴化鉀（分析純） 天津市光復精細化工研究所；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Allegra 64R低溫高速離心機 美國Beckman公司；FD 5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司；AKTA-蛋白質純化儀 美國GE公司；PE Pyris 6差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國PULUS TA.XT公司；1600PC紫外-可見分光光度計上海美普達儀器有限公司；MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）系統 美國尼高力公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆11S球蛋白的制備

根據Bojórquez-velázquez等[11]的方法。制備步驟如下：

大豆→脫皮→粉碎→過60 目篩→正己烷脫脂→脫脂大豆粉→與水混合（料液比1∶15（g/mL））→調節pH 7.5→提取2 h→離心分離（10 000×g，15 min）→取上清液→添加亞硫酸鈉（0.98 g/L）→提取1 h→調節pH 6.4→4 ℃過夜→離心分離（12 000×g，20 min）→沉淀→凍干→大豆11S球蛋白粗提物。

應用AKTA-蛋白質純化儀和HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade凝膠制備級預裝柱，對大豆11S球蛋白粗提物進行純化。根據Yadav等[12]的方法，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白質組成，分離膠為12%，濃縮膠為4%。蛋白質量濃度為1 mg/mL，上樣量為10 μL，電泳結束后考馬斯亮藍R250進行染色，分析亞基組成。通過光密度掃描結果顯示酸性亞基和堿性亞基之和占該泳道光密度強度的92%，即提取的大豆11S球蛋白純度約為92%。

1.3.2 大豆11S球蛋白的熱處理

將一定量大豆11S球蛋白溶于50 mL、0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，配制成5%的蛋白溶液，蛋白質濃度采用Lowery法測定，參比蛋白為牛血清白蛋白。將蛋白溶液分別密封于加熱套管中在溫控水浴鍋中分別進行80、90 ℃和100 ℃的熱處理，熱處理時間分別為10、20、30、45、60 min和90 min。

1.3.3 熱性質測定

參考Tang Chuanhe等[13]的方法，利用PE Pyris 6-DSC儀測定大豆11S球蛋白樣品的熱力學特性。稱取5 mg的樣品放入鋁盒中，加入10 μL、0.01 mol/L的磷酸緩沖液，壓盤密封，室溫條件下放置6 h；將平衡好的樣品放到DSC操作臺左側，空白鋁盒放在右側。溫度掃描范圍為20～120 ℃，升溫速率為10 ℃/min，在120 ℃保持1 min；隨后以30 ℃/min的速率降溫至20 ℃。利用Pyris 6.0軟件進行數據采集和處理得到大豆11S球蛋白的DSC曲線，峰值溫度為蛋白質的變性溫度（Td），曲線與基線間的面積確定熱焓變（ΔH）。

1.3.4 溶解性測定

參考Samoto等[14]的方法。稱取100 mg大豆11S球蛋白樣品分散于10 mL的去離子水中，磁力攪拌30 min后，12 000×g離心20 min。上清液經適度稀釋，采用Lowry法測定稀釋后的上清液中蛋白質的含量，以牛血清白蛋白為標準物制作標準曲線。蛋白質的溶解性表示為上清液中蛋白質量與樣品中總蛋白質量的比值。溶解性按下式計算：

1.3.5 FTIR測定

參照Zhao Chengbin等[15]的方法。將凍干樣品置于干燥器內用P2O5充分干燥，稱取1 mg樣品，與100 mg溴化鉀研磨混勻壓片后進行FTIR測定。在數據采集期間，為了減少水蒸汽紅外吸收的干擾，持續用干燥的N2淋洗測量室。測定波數范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，波數精度為0.01 cm-1，掃描次數為64 次，環境溫度為25 ℃。譜圖處理利用Systat的Peakfit Version 4.12軟件擬合，通過計算各子峰積分面積得到二級結構4 種類型的相對含量。

1.4 統計分析

每個樣品重復3 次實驗，ANOVA差異顯著性分析利用SPSS V17.0軟件完成，P值小于0.05為顯著性差異，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 熱處理對大豆11S球蛋白熱性質影響

表1 熱處理大豆11S球蛋白DSC分析參數Table 1 DSC characteristics of 11S glycinin before and after heat treatment

變性溫度（Td）反映蛋白質的熱穩定性，Td越高則熱穩定性越好，Td越低則熱穩定性越差。熱焓變（ΔH）表征蛋白質分子的聚集程度，反映有序結構所占比例[16]，ΔH越大說明蛋白質的結構越緊密、含有的氫鍵數量越多、構象越穩定，ΔH越小說明蛋白質的結構越伸展、含有的氫鍵數量越少、構象越不穩定。由表1可知，未經熱處理的大豆11S球蛋白的Td為（91.52±0.11） ℃，ΔH為（13.02±0.21） J/g。Zhao Chengbin等[17]采用DSC對大豆11S球蛋白進行分析，發現蛋白質的Td值分布在85～93 ℃范圍內，這與本研究得到的結果相似。相對于未經熱處理的大豆11S球蛋白而言，90 ℃熱處理10 min能夠導致蛋白質Td和ΔH的降低；在100 ℃熱處理20 min條件下，大豆11S球蛋白的吸熱峰消失，表明蛋白質發生完全變性。造成這種現象的原因可能是由于熱處理降低了蛋白質分子間的相互作用，使得蛋白質分子發生一定程度的去折疊展開，分子內部的疏水基團在此過程中發生部分外露，蛋白質亞基組分解離[13]，從而使DSC檢測加熱誘導分子展開需要的熱量減少，使Td和ΔH降低，導致蛋白質發生部分或完全變性。

2.2 熱處理對大豆11S球蛋白溶解性的影響

圖1 熱處理對大豆11S球蛋白溶解性的影響Fig. 1 Effect of heat treatments on the solubility of 11S glycinin

在一定條件下，對大豆蛋白進行熱處理會在一定程度上誘導大豆蛋白形成可溶性或不溶性的蛋白聚集體，從而改變大豆蛋白的溶解性。從圖1可以看出，大豆11S球蛋白的溶解性在不同熱處理條件下發生了一定程度的改變。經過80 ℃熱處理后，大豆11S球蛋白的溶解性隨著熱處理時間的延長而逐漸降低，這與Mori等[18]報道的一致。經90 ℃和100 ℃熱處理后，大豆11S球蛋白的溶解性呈先降低后又小幅度升高的趨勢，且100 ℃熱處理的大豆11S球蛋白溶解性先降低后升高所需的熱處理時間比90 ℃熱處理時間短。整體來看，熱處理主要是降低了大豆11S球蛋白的溶解性。

大豆11S球蛋白經熱處理后表現出的變化趨勢可能是由于熱處理改變了大豆11S球蛋白的空間結構和表面電荷所致。在未經熱處理的球蛋白溶液中，蛋白質分子呈現出一種卷曲的緊密結構，表面被水化膜包圍，具有相對的穩定性。熱處理過程破壞了大豆11S球蛋白分子的天然結構，加熱后的蛋白分子結構去折疊展開，使包埋于球蛋白結構內部的疏水基團暴露出來，相應降低了處于球蛋白分子外部親水性基團的比例，從而使11S球蛋白溶解性降低[19]。此外，熱處理引起蛋白分子結構的展開也可能會導致分子表面帶電氨基酸重新排布，使蛋白表面電荷發生改變，對親水性/疏水性平衡產生影響，從而導致溶解性降低。然而，當溫度接近變性溫度和處理時間達到一定值時，蛋白分子已經基本上達到最大化的伸展，再繼續升高溫度或延長處理時間會使蛋白質分子運動加劇，分子間交聯機率增加，伸展開的大豆11S球蛋白分子之間通過疏水相互作用可以結合形成可溶性聚集體，使蛋白分子的疏水基團重新包裹在蛋白質分子內部[20]。在90 ℃熱處理超過30 min和100 ℃熱處理超過20 min時，大豆11S球蛋白的溶解性均有一定程度的升高，這可能是形成可溶性聚集體造成的。

2.3 熱處理大豆11S球蛋白的FTIR分析

FTIR能夠提供蛋白質分子中的氨基基團、酰胺I帶、酰胺II帶、酰胺III帶、蛋白質環狀結構中的C—C振動和C—O—O糖苷鍵振動的波段信息[21]。如圖2所示，其中酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）的譜峰對于蛋白質結構分析最為重要，與蛋白質的二級結構之間存在一定的對應關系[22]。利用波段縮小技術將FTIR譜圖中的酰胺I帶細分，得到大豆11S球蛋白二級結構的定性定量信息[23]。不同熱處理條件下大豆11S球蛋白的FTIR譜圖分析依次進行基線校正、去卷積處理、二階導數擬合處理，經多次擬合確保擬合殘差最小[24]。如圖3所示，確定擬合圖譜中各子峰與二級結構類型的對應關系，通過計算各子峰積分面積得到二級結構4 種類型的相對含量。各子峰與二級結構對應關系：1 650～1 660 cm-1為α-螺旋，1 610～1 640 cm-1為β-折疊，1 661～1 700 cm-1為β-轉角，1 640～1 650 cm-1為無規卷曲，1 612 cm-1附近的吸收峰為蛋白質和多肽的側鏈吸收[25]。

圖2 熱處理條件下大豆11S球蛋白FTIR譜圖Fig. 2 FTIR spectra of 11S glycinin under different heat treatment conditions

圖3 未經熱處理大豆11S球蛋白去卷積酰胺I帶二階導數擬合圖譜Fig. 3 Second-derivative fi tting spectra in the amide I region for unheated 11S glycinin

2.4 熱處理對大豆11S球蛋白二級結構的影響

圖4 熱處理條件下大豆11S球蛋白二級結構相對含量的變化Fig. 4 Changes in secondary structure contents of 11S glycinin under different heat treatment conditions

如圖4A所示，在80 ℃熱處理條件下，隨熱處理時間的延長，大豆11S球蛋白二級結構中α-螺旋結構相對含量逐漸降低，而β-折疊和無規卷曲結構相對含量逐漸升高，β-轉角結構相對含量變化較小，這表明α-螺旋結構逐漸轉變為β-折疊和無規卷曲結構。Moriyama等[26]對熱變性過程中牛血清蛋白的二級結構進行研究，發現隨著加熱時間的延長，蛋白質中α-螺旋結構相對含量逐漸降低，而β-折疊和無規卷曲結構相對含量逐漸增加，這與本實驗結果一致。分析原因可能是在加熱過程中11S球蛋白分子相鄰肽鏈之間的氫鍵受到破壞，使蛋白質分子內α-螺旋結構隨之展開并形成松散的無規卷曲結構[27]，從而使α-螺旋結構相對含量降低而無規卷曲結構相對含量升高。蛋白質分子中β-折疊結構是一種相當伸展的結構，由于氫鍵作用，β-折疊結構易存在于蛋白質聚集體的內部。熱處理使β-折疊結構相對含量增加的原因可能是由于11S球蛋白分子內部的α-螺旋結構解旋后發生了分子間的相互作用產生較多的β-折疊結構[28]。與α-螺旋結構相比，β-折疊結構的弱水合作用使其在熱聚集體和網絡結構的形成過程中具有重要作用，這是由2 種結構中水分子與羰基基團相互作用幾何學分布差異造成的[29]。

如圖4B、C所示，在90 ℃和100 ℃熱處理條件下，隨熱處理時間的延長，大豆11S球蛋白中α-螺旋和β-折疊結構相對含量逐漸降低，而β-轉角和無規卷曲結構相對含量逐漸升高，表明大豆11S球蛋白分子的α-螺旋和β-折疊結構向β-轉角和無規卷曲結構轉變。這種結構改變可能與高溫處理條件下大豆11S球蛋白中分子發生變性有關，發生變性的蛋白分子內部氫鍵遭到破壞，蛋白質分子去折疊展開，而α-螺旋和β-折疊結構主要是以氫鍵為作用力，因此氫鍵的破壞導致二者含量的降低[30]。此外，β-轉角和無規卷曲結構可能是由更為有序結構單元轉化而來，熱聚集體分子間的β-折疊結構也易于轉變為β-轉角結構[31]，從而導致β-轉角和無規卷曲結構相對含量的升高。由此推斷，β-轉角和無規卷曲結構對熱聚集體的形成具有重要作用。

3 結 論

熱處理能夠使大豆11S球蛋白Td和ΔH降低，甚至沒有吸熱峰，說明熱處理導致蛋白質發生部分或完全變性。80 ℃熱處理使大豆11S球蛋白的溶解性逐漸降低，這可能是由于熱處理改變了蛋白質的空間結構和表面電荷所致。經90 ℃和100 ℃熱處理后，11S球蛋白的溶解性呈先降低后升高的趨勢，溶解性的升高可能是形成可溶性聚集體造成的。FTIR分析表明，80 ℃熱處理能夠使大豆11S球蛋白二級結構中的α-螺旋結構逐漸轉變為β-折疊和無規卷曲結構。90 ℃和100 ℃熱處理使α-螺旋和β-折疊結構向β-轉角和無規卷曲結構轉變。二級結構的變化可能與熱處理條件下大豆11S球蛋白中分子發生變性有關，發生變性的蛋白分子內部氫鍵遭到破壞，蛋白質分子去折疊展開，從而導致蛋白質內二級結構發生相互轉變。