中西醫結合有效逆轉乙肝肝纖維化的目標人群特征和作用機制

孫 鑫 彭 淵 呂 靖 趙志敏 楊 濤 陶艷艷 胡旭東 劉成海,

(1 上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝病研究所，上海，201203； 2 上海市中醫臨床重點實驗室，上海，201203； 3 上海中醫藥大學基礎醫學院生物教研室，上海，201203)

慢性乙型病毒性肝炎是嚴重威脅人類健康的重大傳染性疾病之一。近年來，隨著疫苗接種與抗病毒藥物廣泛應用，慢乙肝的治療取得了巨大進展。但是，有效抑制乙型肝炎病毒(Chronic Hepatitis B，HBV)后，肝纖維化肝硬化等后期階段疾病依然存在，目前尚無抗肝纖維化生物或化學藥物，中醫藥具有抗肝纖維化的獨特優勢，抗乙肝病毒藥物與抗肝纖維化中藥聯合應用可促進乙肝肝纖維化逆轉。探索并回答中西藥物聯用療效提高的關鍵機制，中醫藥在其中的作用，其治療應答的目標人群特征，將發現中西醫結合方案有效逆轉乙肝肝纖維化目標人群的主要生物學與中醫證候特征，闡明中西醫結合有效治療乙肝肝硬化的主要原理及中藥作用特點，建立臨床與基礎密切結合的中西醫結合肝纖維化轉化醫學研究模式，促進基礎研究與臨床實踐的共同發展進步。

1 肝纖維化是影響慢乙肝患者預后的重要病理特點，抗肝纖維化是中醫優勢領域，抗乙肝病毒藥物與抗肝纖維化中藥聯合應用可促進乙肝肝纖維化逆轉

肝纖維化以肝臟的細胞外基質(Extracellular Matrix，ECM)過度增生和異常沉積為特征，存在于大多數慢性肝病，是慢性肝炎向肝硬化發展的關鍵病理過程，可引起肝臟結構與功能異常，嚴重威脅患者健康。目前乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染依然是我國慢性肝病的主要原因，HBV介導的免疫應答致使肝細胞損傷與炎性反應反復存在[1]，促使患者進展為肝硬化甚或肝癌。針對HBV復制的病因治療可部分減輕與逆轉肝臟纖維化[2-3]，但作用有限。乙肝患者在恩替卡韋(Entecavir，ETV)等核苷酸類治療1年的肝纖維化改善率僅為39%，部分患者病毒有效控制后肝纖維化依然存在或者發展[4]；對于初始治療時纖維化顯著的慢乙肝高度肝纖維化或肝硬化患者，即使療程延長到5～10年，仍有1/3患者肝纖維化未能改善[5-6]。究其原因，主要有以下幾個方面：其一，肝星形細胞(Hepatic Stellate Cell，HSC)一旦活化可自分泌多種細胞因子維持活化的持續；其二，肝臟微環境破壞，如肝組織炎性免疫細胞遷移、表型與功能異常，導致肝臟細胞與細胞、細胞與基質間復雜病理影響；其三，沉積的ECM降解減少。因此，對于乙肝肝硬化患者，抗病毒治療是必須的，而針對HSC的活化與ECM代謝的抗肝纖維化治療也是必要的。

近半個世紀來，我國中醫中西醫結合肝病工作者面對臨床需求，開展了大量臨床與基礎研究，出現了抗肝纖維化中成藥、經驗方或中西醫結合方案，闡明了有效方藥的部分作用機制，形成了全國行業性中西醫結合肝纖維化診療指南，并且進行了中醫藥抗肝纖維化的美國FDA臨床注冊試驗等，這些成績與進步，使得肝纖維化治療成為中醫中西醫結合領域的優勢方向。由丹參、桃仁、蟲草菌絲、松黃、五味子、絞股藍組成的扶正化瘀方(Fuzheng Huayu Formula，FZHY)，是上海中醫藥大學肝病研究所研制的抗肝纖維化中藥新藥。文獻薈萃分析發現，FZHY聯合抗病毒藥物可改善乙肝肝纖維化患者癥狀與血清纖維化指標[7]。我們與瑞金醫院感染科合作開展的FZHY聯合ETV治療乙肝肝纖維化小樣本、隨機、雙盲、安慰劑平行對照臨床試驗結果顯示，FZHY聯合ETV治療48周，肝組織學逆轉率顯著高于單用ETV組。2014年在國家傳染病重大科技專項(2014ZX10005001)支持下，我們課題組牽頭聯合全國20家臨床醫院開展了中醫藥聯合ETV治療乙肝肝硬化的大樣本臨床研究，旨在較大規模、高質量獲得中醫藥逆轉高度肝纖維化的循證醫學證據，建立有效的臨床方案，促進肝纖維化治療這一世界性醫學難題的逐步解決。

2 乙肝早期肝硬化患者存在肝臟區域免疫微環境紊亂的病理特征，是影響高度肝纖維化難以消退逆轉的重要原因

肝纖維化具有形成發展與消退恢復2個階段。既往認為，肝纖維化一旦形成，則難以逆轉。但近年來研究證實，不僅肝纖維化是可逆的，一定程度的肝硬化也是可逆的[8]。無論肝纖維化的發展還是消退，其機制均十分復雜，涉及到肝實質細胞損傷、HSC的活化、自然殺傷細胞(Natural Killer Cell，NK細胞)與肝巨噬細胞(Macrophage，Mφ)(包括庫普弗細胞)的功能異常、ECM的代謝失衡等多個方面。乙肝肝硬化患者肝臟高度纖維化，而活化HSC的凋亡消退與肝臟沉積ECM降解是高度肝纖維化逆轉的重要環節，該環節涉及到NK細胞與Mφ(包括庫普弗細胞)的免疫調節、HSC的視黃醇代謝等，且這些細胞相互聯系，構成影響肝纖維化逆轉的“免疫微環境”。見圖1。

HSC是肝纖維化的關鍵效應細胞，也是肝內重要的免疫調節細胞與機體視黃醇代謝關鍵細胞，且這種視黃醇代謝與HSC活化及其免疫調節有重要聯系。靜止期HSC胞內主要為視黃醇，細胞活化時，視黃醇在乙醇脫氫酶作用下變為視黃醛，視黃醛既可通過短鏈脫氫酶/還原酶再逆轉化為視黃醇，也可通過乙醛脫氫酶轉變為視黃酸(Retinoid Acid，RA)。RA則可進入核內與其核受體相結合，調控目的基因表達，而完全活化的HSC脂滴消失，缺乏視黃醇與RA。有研究表明：視黃醇代謝酶ADH3可刺激I型膠原基因表達與轉化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)活化，有明顯的促進肝纖維化作用[9]。

圖1 肝纖維化“免疫微環境”示意圖

人肝內NK細胞占淋巴細胞比例高達30%～50%，在肝臟中優勢存在，無需抗原提呈即可對多種靶細胞發揮細胞毒作用，并由其激活型與抑制型受體的平衡所決定。肝NK細胞與HSC聯系密切，且與視黃醇代謝有關。一方面，NK細胞可“殺傷”早期活化與衰老的HSC，主要通過視黃酸早期誘導基因1(RAE-1)、干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand，TRAIL)等途徑[10]。另一方面，HSC作為免疫調節細胞負性調控NK細胞，主要通過細胞因子信號轉導抑制因子1(SCOS1)、TGF-β1-Smads信號通路等途徑抑制NK細胞的增殖分化[11]。因此，提高NK細胞的活性，使NK細胞殺傷活化HSC功能增強，是逆轉肝纖維化的重要措施之一。

肝內Mφ數量眾多，定居于肝臟的Mφ占全身組織定居Mφ總數的80%～90%[12]，是肝內重要的固有免疫細胞，在維持肝臟免疫穩態中發揮重要作用，其對肝纖維化有“雙刃劍”作用。在肝臟炎性反應與纖維化形成階段，肝內Mφ通過經典途徑激活為促炎性的M1型，而在肝纖維化消退階段，肝內Mφ通過旁路激活為恢復性或抗炎性的M2型。Mφ其主要通過明膠酶MMP-9、彈性膠原酶MMP-12、TRAIL及其受體等途徑促進肝纖維化消退[13]，此外Mφ吞噬清除細胞凋亡碎片以及增強NK細胞活性，也有助于肝纖維化的消退。HSC也可影響Mφ的募集與分化，RA可促進肝內Mφ的活性[14]。因此，調控肝Mφ的分化，使Mφ更多的發揮恢復性亞群的功能，也是逆轉高度肝纖維化的重要措施。

在慢性乙型肝炎或肝硬化時，NK細胞等免疫細胞活性下降。研究發現HBV感染可負調控NK細胞功能，如促使NKG2A等抑制型受體與共抑制分子Tim3表達增多[15]，而激活型受體表達下降，抑制樹突狀細胞與NK細胞間的細胞通信等，從而抑制NK細胞活性等。部分患者即使有效控制HBV復制，肝臟NK細胞仍處于抑制狀態[16]，提示除了HBV因素，尚有抑制NK細胞等免疫細胞活性的其他因素。因此，探討肝NK細胞等免疫逃逸的負性調節機制與干預作用，將有助于闡明肝纖維化的免疫病理機制、發展肝纖維化治療新策略。

3 調節肝臟區域免疫微環境，調節活化HSC與肝臟免疫細胞之間聯系可能是中醫藥逆轉高度肝纖維化的優勢

我國傳統醫學蘊藏著豐富的免疫學思想，《素問·六微旨大論》云“亢則害，承乃制，制則生化”。從免疫學角度而言，“亢則害”就是機體免疫自穩態失調；“承乃制”則是通過調控使免疫自穩功能恢復，機體生長代謝等生理功能正常，達到“制則生化”之境地。中藥與免疫調節有著天然而緊密的聯系：中藥具有“扶正”功能，能夠增強機體免疫功能，促進單核-巨噬細胞、NK細胞等生理功能；中藥也具有“祛邪”作用，能夠免疫抑制，減少炎性反應遞質的釋放，抑制或消除抗體的產生，抑制T細胞的增殖等，以達到“邪去而正安”的目的[17]。這種雙向免疫調節作用正體現了中醫“整體觀”與“陰陽平衡”理念。

既往研究發現，FZHY抗肝纖維化的機制包括保護肝細胞損傷與促進肝細胞再生，抑制HSC活化，促進膠原降解等[18-19]；有研究提示其作用機制還與免疫調節有關：FZHY治療肝硬化患者80例3個月，可有效提高患者外周血的NK細胞活性及T細胞數量[20]；FZHY可提高肝纖維化小鼠的肝臟NK細胞活性，而對ASGM-1抗體抑制體內NK細胞的模型小鼠抗肝纖維化效應減弱，證實其抗肝纖維化效應與激活NK細胞密切相關[21]；FZHY可通過抑制肝Mφ的激活及其旁分泌作用，而抑制HSC活化等[19]。我們也發現FZHY主要藥物丹參與蟲草菌絲抗小鼠肝纖維化的作用與提高肝臟NK細胞活性有關。這些結果均提示，FZHY可能具有調節NK細胞與肝Mφ等肝臟區域免疫的作用，與抗病毒藥物協同作用，促進活化HSC凋亡與肝纖維化消退。

4 發現有效人群的生物學與中醫證候特征，將有助于乙肝肝纖維化的精細分層與中西醫結合精準治療

疾病是環境與基因相互復雜影響的結果，常常具有異質性。例如，均為慢性丙型肝炎患者，但發展為肝纖維化的時間相差可達5倍，且IL28-B基因多態性可明顯影響到患者對干擾素-α的臨床療效[22-23]。因此，需重視疾病分層，以準確判斷預后，選擇適應人群，精準醫療以提高臨床診治水平。

肝臟是機體的代謝器官也是免疫器官，因此肝臟疾病的異質性除了常用的代謝組學所表征，免疫學的變化也是重要表征特點。代謝組學可發現藥物代謝組及其療效預測的生物標志物，通過與轉錄組等相結合，可以構建生物分子網絡，發現與交叉驗證影響代謝的關鍵通路及其節點。肝臟雖不是“專職”免疫器官，但是其天然免疫優勢存在，對于維護肝臟微環境穩定、肝臟疾病的發生變化及全身免疫反應調節等均發揮重要作用[24]。因此，基于影響乙肝肝纖維化消退轉歸的肝臟區域免疫關鍵病理，結合視黃醇代謝這一肝臟特有、與纖維化與免疫調節均密切相關的物質代謝，且聯系全身的免疫蛋白質組變化，可以發現對治療方案應答差異的免疫學重要特征。

中醫證候是疾病過程中某一階段機體在內外致病因素作用下的綜合反應，中醫重視辨證論治與病證結合，早在漢代《金匱要略》中即有《黃疸病脈證并治》等論述。《肝纖維化中西醫結合診療指南》[25]指出：肝纖維化的基本病機為正虛血瘀，而主要證型有肝膽濕熱、肝郁脾虛與肝腎陰虛，在辨證治療時，主要證型與治法、基本證型與治法兩者必須相互結合，靈活運用[26]。因此，在中醫基本治法基礎上，通過差異療效的證候因素分層分析，可以發現影響療效的中醫主要證候，并了解基本證候的主要生物學基礎。

5 科學假說的提出與主要工作思路

基于中醫藥抗肝纖維化的優勢與免疫調節特點，重大專項乙肝早期肝硬化患者中西醫結合方案的組間、組內療效差異現象，肝臟區域免疫微環境在肝纖維化逆轉中的重要作用，我們提出以下科學假說：1)調節肝HSC與NK細胞、肝Mφ之間相互聯系，改善肝纖維化免疫微環境，是中西藥物聯用逆轉乙肝高度肝纖維化的重要作用機制；2)中藥扶正化瘀方的作用特點在于調節活化HSC的視黃醇代謝與轉化生長因子(TGF)-β1信號轉導，以恢復NK細胞的免疫殺傷功能；3)該被治療藥物改善的肝臟免疫微環境是有效人群的重要生物學表現，與機體血清代謝標志物及其中醫證候構成效應目標人群的主要特征。

本研究將借助傳染病重大科技專項的乙肝肝硬化臨床研究生物樣本，結合動物與細胞實驗，圍繞肝纖維化免疫微環境中HSC、NK細胞與肝Mφ的相互聯系及其視黃醇代謝，臨床與基礎、區域免疫與整體變化等相結合研究，以驗證以上科學假說，發現有效方案的目標人群特征，闡明其主要治療機制與中藥作用特點，促進中西醫結合肝病的精準醫療與基礎研究發展。