腎腦復元湯對阿爾茲海默病大鼠海馬區神經保護作用及對堿性成纖維生長因子、腦源性神經營養因子表達的影響

盛 望 王瑾茜 李旭華 胡國恒

(1 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙，410007； 2 湖南中醫藥大學，長沙，410007)

阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)以漸進性記憶和認知障礙為特征，是多種疾病病因引起的神經變性疾病。主要發生在老年人，俗稱老年癡呆。其機制與大腦局部，尤其是海馬區形成神經細胞外以β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積為核心形成的老年斑有關。中醫學認為腦髓是由腎精化生而成，腎精是腦髓形成的物質基礎。在此基礎上選藥組方而成的腎腦復元湯是治療腦疾病方面的有效方藥[1]。基于此，本研究采用Aβ25-35注入大鼠側腦室制備AD大鼠模型，旨在為補腎經方-腎腦復元湯治療阿爾茨海默病，重建神經功能提供實驗依據，從而揭示從腎治腦法對阿爾茨海默病的作用機制，為臨床防治阿爾茨海默病提供新的治療靶點和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取健康雄性清潔級SD大鼠120只，體重(250±50)g(湖南中醫藥大學實驗動物中心提供)。許可證號SYXK(湘)2015-0001。自由進食、飲水，溫度24～25 ℃，濕度22%，同等條件下分籠適應性飼養1周。

1.1.2 藥物 腎腦復元湯：熟地黃10 g、山茱萸10 g、黃芪30 g、山藥15 g、紅景天20 g、川芎10 g、丹參10 g、牡丹皮10 g、赤芍10 g、地龍10 g、當歸尾10 g(均購于湖南省中醫藥大學第一附屬醫院)。

1.1.3 試劑與儀器 腦立體定向儀(TeoLinc，型號：MD2000)石蠟切片機(Leica，型號：RM2255)臺式離心機(Thermo Fisher，型號：7900HT)Aβ25-35(Sigma，貨號：#12941)兔抗bFGF試劑盒(Abcam,貨號：ab106959)兔抗BDNF試劑盒(Abcam,貨號：ab108319)試劑盒：TUNEL試劑盒(Abcam,貨號：ab66108)0.2%溴酚藍(Amresco，貨號：0449-100G)β-actin抗體(碧云填生物技術研究所，貨號：H015)

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 除空白組(30只)外，造模成功后將動物隨機分為模型組(30只)、腎腦復元湯組(30只)、對照組(30只)3組。以上4組按處死時間分為造模后1周(7 d)、2周(14 d)、3周(21 d)3個時相，每個組每個時相保證造模成功10只動物。采用立體定向儀下將Aβ25-35注入大鼠側腦室制備AD模型。將Aβ25-35溶于無菌生理鹽(4 g/L)，用前37 ℃孵育1周以上。腹腔注射水合氯醛0.35 g/kg麻醉動物。將大鼠固定于立體定位儀上，選雙側海馬齒狀回背側細胞帶為注射區。定位坐標為前囟后3.0 mm，左側旁開2.0 mm，硬腦膜下2.9 mm，門齒鉤平面低于耳間線平面2.4 mm。β-淀粉樣蛋白組以10 μL微量注射器注射β-淀粉樣蛋白溶液3 μL(控制注射速度為0.3 μL/min)，留針5 min以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針；假手術組以生理鹽水注射于海馬。

1.2.2 給藥方法 模型組、假手術組每天灌胃3 mL蒸餾水，中藥組選用腎腦復元湯，人臨床用量為125 g/d，按11.25 g/kg劑量灌胃;陽性對照藥組選用鹽酸多奈哌齊，人臨床用量為5 mg/d，按0.92 mg/kg劑量灌胃。各組大鼠每天每組均各灌胃1次，直至處死。

1.2.3 指標檢測與方法 取出腦組織，使用4%多聚甲醛內固定，取雙側端腦前2/3，切片行HE及TUNEL染色，取雙側端腦后1/3，放置于-80 ℃冰箱儲存備作Western Blot，以檢測堿性成纖維生長因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)，腦源性神經營養因子(Brain Derived Neurotrophic factor，BDNF)蛋白的表達[2]。

2 結果

2.1 組織學結果通過HE染色后顯示，1周后假手術組細胞排列規整，胞核居中，模型組可見梗死區細胞呈病灶性聚集，排列紊亂，病灶周圍有炎性細胞浸潤，水腫，壞死發生；中藥組細胞排列較規整，壞死程度較輕，但仍然有炎性反應，水腫；對照組可見心肌細胞致密生長，且炎性反應，水腫較為輕。見圖1。

圖1 第7天時海馬區細胞病理染色(HE×)

注：A,B,C,D分別指假手術組、模型組、中藥組、對照組

2.2 凋亡細胞結果 通過TUNEL染色標記凋亡細胞，檢測后顯示，各組大鼠均有明顯的細胞凋亡表現，但隨時間推移凋亡逐漸減輕；中藥組(第14天)、對照組(第7、14天)細胞凋亡較模型組減輕(P<0.05)；對照組第7天時凋亡較中藥組減輕(P<0.05)。見圖2。

圖2 第7天時皮層細胞(TUNEL染色×400)

注：A,B,C,D分別指假手術組、模型組、中藥組、對照組；箭頭示凋亡細胞

表1 第7天時各組大鼠海馬區bFGF,BDNF的蛋白表達

注：與模型組比較，*P<0.05

圖3 第7天時各組大鼠海馬區bFGF,BDNF的蛋白表達

注：A,B,C,D分別指假手術組、模型組、中藥組、對照組

2.3 bFGF,BDNF表達結果 大鼠造模后，bFGF，BDNF表達較假手術組明顯升高；與模型組比較，中藥組(第7天)、對照組(第7天)bFGF，BDNF表達上升(P<0.05)；中藥組(第14天)bFGF，BDNF表達較對照組上升(P<0.05)。見表1，圖3。

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)的發病機制十分復雜，隨著對AD研究的深入，有關AD診斷及治療指南得到不斷修改完善，但迄今其治療仍是難點。目前對AD的治療除心理社會干預及環境行為改善外，主要藥物治療還是與改善神經元突觸的傳遞功能，或者保護膽堿能神經元免受興奮性氨基酸毒性的破壞等方面有關，這也僅僅只是暫時緩解患者認知功能的減退過程[3]。目前藥物治療效果不理想，因此尋找有效的治療方法迫在眉睫。中醫學認為，AD屬于“呆證”“健忘”“癡呆”等范疇[4]。《靈樞·海論》曰：“腦為髓之海”“髓海不足，則腦轉耳鳴，脛酸，眩冒，目無所視，懈怠安臥”。由于腦為元神之府，總統諸神，故AD病位主要在腦。而腦髓是由腎精化生而成，腎精是腦髓形成的物質基礎。中醫學認為腦髓是由腎精化生而成，腎精是腦髓形成的物質基礎，其發病主要以腎虛為本，瘀血為標，本虛標實[5]。因此，當活血化瘀同時，要考慮補腎生髓，即中醫“標本兼治”。“治標”為活血祛瘀，“治本”補腎生髓。根據“腎腦同治”方論而成的腎腦復元湯是治療AD的有效方藥，具有益腎生髓、活血通絡之功效[6]。其組方為：干地黃10 g、黃芪30 g、山藥15 g、山茱萸10 g、紅景天20 g、赤芍10 g、牡丹皮10 g、地龍10 g、當歸尾10 g。經臨床應用證明該方可明顯改善AD患者的神經功能，提高臨床療效[7]。

近年來，對神經營養因子家族在阿爾茲海默病中的治療作用及機制引起廣泛關注。有研究發現，神經生長因子能有效保護基底前腦膽堿能神經元受損傷導致的神經變性、改善空間記憶，因而有望成為治療AD的有效途徑。堿性成纖維生長因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)及腦源性神經營養因子(Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF)同屬神經營養因子家族，在AD病中對腦組織損傷修復起著重要的作用。是神經營養因子家族的一員[8]，有研究發現，AD患者血液和中樞神經系統中BDNF的表達水平呈現持續下降的趨勢。BDNF可以調節神經元的存活、分化及可塑性[9]，并且這種能力是通過激活高親和力受體TrkB和低親和力受體p75NTR而實現。研究表明，通過降低TrkB從而減少BDNF信號可導致空間記憶受損，而TrkB表達的適度增加則可以增強記憶。這一系列研究表明，BDNF可能在AD發病機制和治療中發揮潛在作用[10]。bFGF屬于FGF家族，是神經營養因子家族的一員[11]。正常情況下，其在腦組織內含量較少，但在阿爾茲海默病后bFGF的表達明顯增加。其可以通過促血管形成、促進神經生長、并抑制神經元凋亡[12-13]。在生理和病理過程中起著重要的作用。近年來有研究發現，bFGF能促進海馬神經元的存活，減輕腦損傷引起的認知障礙，改善AD模型大鼠基底前腦、皮層和海馬膽堿能神經纖維密度，提高學習記憶能力[14]。

本研究結果表明，與模型組比較，腎腦復元湯可以明顯改善細胞壞死，并促進腦梗死組織修復，抑制神經元凋亡，從而改善神經細胞的存活率；且觀察到BDNF及bFGF的表達水平呈上升趨勢，證明BDNF及bFGF參與了AD病神經細胞修復的過程。此外在第7天時，BDNF及bFGF均呈高峰值，第7天后有所下降，證明BDNF及bFGF峰值期應在第7天左右。另外，在AD造模后早期(第7天)鹽酸多奈哌齊療效更加顯著，在后期(第14，21天)，二者療效差異無統計學意義，說明對照組西藥鹽酸多奈哌齊發揮治療效應主要是在早期，而腎腦復元湯應在恢復期。這與中藥“緩則治本”的原則相應。因此，本實驗從動物實驗角度初步揭示了腎腦復元湯可能的作用靶點，其作用機制可能與通過改善中老年人的腦內環境促進神經營養因子的合成分泌，修復受損腦組織，從而改善神經功能有關。