益氣解毒通絡顆粒對乙肝肝硬化患者肝星狀細胞標記物VEGF和PDGF-AB的影響

赫偉麗 苑曉晨 趙 帆 徐光福 張愛軍

(1 北京中醫藥大學東直門醫院,北京,100700; 2 中國醫學科學院&北京協和醫學院微循環研究所,北京,100005)

2010年乙肝報告發病率顯著下降,其后在2013年再次明顯下降[1],說明隨著我國的乙肝防治工作加強,整體發病例數在降低。但根據2006年全國乙型肝炎血清流行病學調查推算,我國仍有慢性HBV感染者約9 300萬人[2]。我國肝硬化患者中,由HBV感染引起的比例為60%[3]。而乙肝病毒相關肝硬化患者的中位生存期為10～12年。一旦進展為失代償,患者常出現因門靜脈高壓導致的食管胃底靜脈曲張破裂出血、腹水、脾功能亢進、肝性腦病、肝腎綜合征等并發癥,死亡風險明顯增加。代償期和失代償期肝硬化患者的5年生存率分別為84%和14%[4]。對于乙肝肝硬化患者,抗病毒治療不能徹底清除病毒[5-6],病毒復制只是誘因,與肝硬化不是直接的因果關系。有的患者已經抗病毒數年但病情仍在進展,加之患者體質各有差異,即使DNA復制陰性者仍可發展至失代償期。所以,抗病毒藥物的問世及使用,雖然取得了巨大的進步,穩定了患者的病情,使之發展進程變慢了,但對部分患者來說,仍然未能徹底改變其門脈高壓癥及并發癥發生的結局。因此,如何控制肝硬化的發展,改善生命質量,延長壽命仍是目前亟待解決的世界性難題。國內外基礎研究發現,只要條件合適,肝硬化完全可以逆轉[7-10]。近年來,大批國內學者及機構致力于中醫藥防治乙肝肝硬化的工作,并取得了一定進展,但因其具體作用機制未明,目前仍難以被大多數專家學者所接受,已成為中醫藥國際化發展的瓶頸。因此,如何將現代醫學的最新研究技術與傳統中醫理論相結合,實現中醫辨證的客觀化和科學化仍然是我們面臨的主要課題。

本研究的“益氣解毒通絡顆?！笔俏以盒旃飧＝淌诮Y合多年的臨床實踐創立的,從以往的臨床研究中已證實其在治療乙肝肝硬化中,具有減輕癥狀、體征,降酶、改善肝纖維化血清學指標及肝臟超聲等作用[11]。本研究是在益氣解毒通絡方使用前后,觀察患者血液中表達的促血管生成的關鍵因子VEGF和PDGF-AB的動態變化,以幫助我們進一步揭示中醫藥療效的本質,探討益氣解毒通絡方治療乙肝肝硬化好轉的分子機制,完善該方治療乙肝肝硬化的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月至2017年10月采用簡單隨機化分組方法,隨機選擇符合入排標準的,在北京中醫藥大學東直門醫院體檢中心體檢健康者15例,肝炎門診就診的乙肝肝硬化患者50例,其中脫落8例,有效病例42例,乙肝肝硬化患者均已規范使用抗病毒藥恩替卡韋分散片治療3個月以上,且HBV-DNA在檢測下限內。在經過一系列檢查項目后,符合研究標準的健康者及患者簽署知情同意,均經醫院倫理委員會批準通過(倫理審批號:ECPJ-BDY-2015-27)。然后對健康者及患者進行血樣采集。

1.2 診斷標準

1.2.1 中醫診斷標準 參照中國中西醫結合學會消化系統疾病專業委員會第五屆學術交流會(1993.11)制定的《肝硬化臨床診斷、中醫辨證和療效評定標準》,經整理擬定診斷標準如下:主癥:肝病面容;脅肋刺痛;脅下痞塊;舌質暗紅或紫暗或紅,舌體胖大,邊有齒痕,舌苔薄黃或黃或黃膩;脈弦細數或弦滑數,或脈小、沉、弱。次癥:脘腹脹滿;納差;神疲乏力;赤絲紅縷;肝掌;腹部脹大;腹壁青筋暴露;吐血或便血。

1.2.1.1 辨病要求 1)具備主癥中三項者,即屬本病;2)具備主癥二項及次癥二項以上者,即屬本病。

1.2.1.2 辨證標準 毒損肝絡,氣虛絡閉型:肝病面容,脅肋刺痛,脅下痞塊,脘腹脹滿,納差,神疲乏力;肝掌,赤絲紅縷,腹部脹大,腹壁青筋暴露,舌質暗紅或紫暗或紅,或見瘀斑,舌下脈絡迂曲,舌體胖大,邊有齒痕,舌苔薄黃或黃或黃膩,脈弦、細、滑或數,或數脈并見,沉取無力。

1.2.2 西醫診斷標準 參照中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會西安會議(2000.9)聯合修訂的《病毒性肝炎防治方案》、國家藥品監督管理局制定的《中藥新藥治療病毒性肝炎的臨床研究指導原則》(2002.5,第1版)、梁擴寰等主編的《肝臟病學》(2006.1,第2版)以及中華醫學會感染病分會發布的《慢性乙型肝炎防治指南》(2010.12),經整理擬定診斷標準如下:1)癥狀:既往具有慢性病毒性乙型肝炎病史,或急性乙型肝炎病程遷延史超過半年,目前有較明顯癥狀如神疲乏力,飲食減少、腹脹、右上腹部疼痛、上消化道出血史等;2)體征:可有肝病面容、肝脾捫痛,可有肝脾腫大,腹水癥或腹部移動性濁音,腹壁與臍周靜脈曲張,可有肝掌,蜘蛛痣等;3)肝功能:可有血清谷丙轉氨酶升高,或谷草轉氨酶升高,血清白蛋白降低,白球蛋白比值異常,或血清總膽紅素升高;4)乙肝表面抗原陽性,乙肝e抗原或e抗體陽性,乙肝核心抗體陽性;5)超聲檢查:超聲提示肝表面包膜欠光滑、凹凸不平或呈鋸齒狀,肝內回聲明顯增多增強,可見斑片狀、網狀、索狀或結節狀的強回聲光團,門靜脈主干內徑>1.4 cm、脾靜脈>1.0 cm;6)CT檢查:少數肝硬化表現為全肝萎縮;更多的表現為尾葉、左葉外側段增大,右葉發生萎縮,部分也表現右葉增大,左葉萎縮或尾葉萎縮,結果出現肝各葉大小比例失調。肝輪廓邊緣顯示凹凸不平,肝門、肝裂增寬以及脾大、腹水、胃底和食管靜脈曲張等門脈高壓征象;7)病理診斷:炎性反應活動度、纖維化程度符合S4G4者。

1.3 納入標準 健康對照組:1)同期健康體檢者15例;2)年齡30～70歲;3)來自于本院體檢中心,既往無疾病史的健康者;4)被充分告知此次研究的研究性質、研究目的、研究可能帶來的利益及傷害后主動愿意參與本實驗研究并簽署知情同意書。乙肝肝硬化患者:任何一名參加本次研究的患者需滿足以下全部入選標準:1)患者被充分告知此次研究的研究性質、研究目的、研究可能帶來的利益及傷害后主動愿意參與本實驗研究并簽署知情同意書;2)年齡30～70歲,患者需要滿足方案當中的中西醫診斷標準,被研究醫生明確診斷為乙肝誘導的肝硬化,乙肝肝硬化患者均已規范使用抗病毒藥恩替卡韋分散片治療3個月以上,且HBV-DNA在檢測下限內;3)所有病史可以被記載和追溯的;4)近6個月來未接受過中醫藥治療。

1.4 排除標準 1)患者不能夠在診斷依據內被明確判斷為乙肝誘導肝硬化的;2)合并有心腦血管、肺、腎和造血系統等嚴重原發性疾病或腫瘤及精神異常患者;由其他疾病用藥后出現不良影響的患者,如正使用激素治療的患者;3)年齡在30歲以下或70歲以上者,妊娠或哺乳期婦女,過敏體質及對本藥過敏;4)患者有致命的癥狀且難以完成實驗要求(如抽血等)的;5)患者伴有糖尿病、慢性腎臟疾病、心腦血管病、眼底病變等微血管損害的疾病及自身免疫系統疾病;6)患者存在藥物濫用史。

1.5 脫落與剔除標準

1.5.1 病例脫落標準 符合納入標準而因某種原因未完成研究的病例,當屬脫落病例。包括受試者自行退出和醫生認定受試者退出的病例。1)受試者依從性差。2)發生嚴重不良事件、并發癥和特殊生理變化不宜繼續接受研究的病例。試驗期間,患者一旦出現急性食管-胃底靜脈曲張出血、頑固性腹水、感染等情況,及早合理采取曲張靜脈套扎術、硬化劑注射等方法止血、控制腹水、抗感染等有效治療措施,待病情穩定以后,可繼續相關中醫藥治療,但本病例血樣按脫落處理。本試驗方案能確實保障患者的安全、健康和權益受到保護,符合倫理學要求,亦符合試驗的嚴謹性要求。3)受試者自行退出的病例。4)未按研究方案規定用藥的病例。

1.5.2 病例剔除標準 不符合納入標準而被誤納入的病例和雖符合納入標準而納入后未曾服藥的病例,需予剔除。

1.6 治療方法 入組患者均已規范使用抗病毒藥恩替卡韋分散片治療3個月以上,在繼續抗病毒藥物治療的前提下,予益氣解毒通絡顆粒劑(主要由生黃芪、茯苓、陳皮、制香附、苦參、土茯苓、三棱、莪術、三七、鱉甲等藥物組成,由北京康仁堂藥業有限公司提供相應藥物的免煎顆粒劑，北京中醫藥大學東直門醫院草藥房制備)治療，1包/次，2次/d，開水沖服；連續用藥治療6個月。

1.7 觀察指標

1.7.1 血樣采集方法 分別采健康者,乙肝肝硬化患者用中藥干預前、用中藥連續干預6個月后的清晨空腹靜脈血3 mL,靜置30 min后,3 000 r/min離心,10 min分離血清,分裝于Eppendorf管中密封,置-70 ℃保存待用。待標本集中后采用酶聯免疫吸附法成批檢測VEGF、PDGF-AB含量,避免反復凍融。

1.7.2 主要儀器 Varioskan Flash多功能酶標儀:美國賽默飛世爾科技公司。

1.7.3 主要規格及技術指標 1)板型:熒光、時間分辨熒光和化學發光:6-1536孔板;光吸收:6-384孔板。2)熒光測量:激發光波長:200～1 000 nm;發射光波長:270～840 nm,檢測靈敏度:<0.4 fmolATP/孔,動態范圍>6個數量級。3)化學發光波長范圍:360～670 nm;掃描波長范圍:270～840 nm;檢測靈敏度:<7 amolATP/孔,動態范圍>7個數量級。4)光吸收檢測:波長范圍:200～1 000 nm;線性測量:0～4 Abs,(96孔板)at 450 nm,<±2%。

1.7.4 檢測步驟 1)加樣:分別設標準孔、待測樣本孔、空白孔。設標準孔7孔,依次加入100 μL不同濃度的標準品,空白孔加100 μL稀釋液,余孔加待測樣本100 μL,酶標板加上覆膜,37 ℃溫育2 h。2)棄去液體,甩干,不用洗滌。3)每孔加檢測溶液A工作液100 μL,酶標板加上覆膜,37 ℃溫育1 h。4)棄去孔內液體,每孔加350 μL洗滌液洗滌,浸泡2 min,甩掉酶標板內的液體,在試驗臺上鋪幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍打,重復洗板3次,最后一次洗滌后,要把孔內的洗滌液完全甩干。5)每孔加檢測溶液B工作液100 μL,加上覆膜,37 ℃溫育30 min。6)棄去孔內溶液,甩干,洗板5次,方法同步驟4。7)每孔加底物溶液90 μL,加上覆膜,37 ℃避光顯色(反應時間控制在25 min內)。8)每孔加終止溶液50 μL,終止反應,此時藍色變黃色,終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現顏色不均一,輕晃酶標板使溶液混合均勻。9)在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后,立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)。

1.8 療效判定標準 根據乙肝肝硬化患者治療前后癥狀積分、體征積分、超聲積分及肝功能數值的變化檢驗臨床療效;檢測得出的乙肝肝硬化患者治療前與治療后的血清VEGF和PDGF-AB的濃度與健康者的濃度水平比較,乙肝肝硬化患者治療后的值接近或向健康者的血清濃度值靠攏,說明治療有效。

1.9 不良反應評定 一旦發現患者出現皮疹、發熱、肝損傷進行性加重、腎功能異常、尿常規異常等情況視為不良反應。

2 結果

2.1 VEGF和PDGF-AB檢測

2.1.1 標準曲線 方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D(A=5.852 71,B=-1.202 28,C=625.650 41,D=0.091 78,r2=0.999 92),說明:根據標準品濃度稀釋后,不同濃度下吸光度值計算標準曲線。見圖1。公式是y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D,然后真實樣本檢測吸光度后,套公式就可以計算出樣本中該蛋白質的濃度。

圖1 標準曲線圖

2.1.2 VEGF檢測結果 乙肝肝硬化患者血清VEGF水平治療前較健康者輕度升高,治療后較治療前及健康者均有所下降,但組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖2 VEGF濃度比較

2.1.3 PDGF-AB檢測結果 乙肝肝硬化患者血清PDGF-AB水平治療前較健康者顯著降低(P<0.001);治療后較治療前有所升高(P<0.05),但仍低于健康者(P<0.05)。見圖3。

圖3 PDGF-AB濃度比較

注：*表示P<0.05;***表示P<0.001

2.2 治療前后臨床療效比較 通過對42例有效病例臨床療效經分析可知:各項癥狀指標積分在治療前后,經t檢驗分析差異有統計學意義(P<0.001),說明益氣解毒通絡顆粒可以改善乙肝肝硬化患者的臨床癥狀。見表1。各項體征指標積分在治療前后,經t檢驗分析,差異有統計學意義(P<0.001),說明益氣解毒通絡顆粒在改善乙肝肝硬化患者的體征方面有效。見表2。治療前后在肝臟超聲積分結果方面,差異無統計學意義(P>0.05),說明經過6個月的治療,肝臟形態未見顯著改善;谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、白蛋白數值在治療前后,經t檢驗分析,差異有統計學意義(P<0.0010),說明益氣解毒通絡顆粒在改善肝功能方面有效;A/G值經t檢驗分析,差異無統計學意義(P>0.05),說明益氣解毒通絡顆粒在短期內很難改善肝臟形態。見表3。

2.3 病例剔除和脫落情況 肝炎門診就診的乙肝肝硬化患者50例,所有病例經審核均符合納入標準無剔除病例;其中8例脫落,有效病例42例。脫落原因:受試者依從性差,未規律服藥2例;受試者于試驗期間,出現急性食管-胃底靜脈曲張出血2例;出現頑固性腹水1例;因進食不潔飲食出現胃腸道感染1例;受試者自行退出試驗2例。

2.4 不良反應觀察 入組病例患者在試驗期間均未出現皮疹、發熱、肝損傷進行性加重、腎功能異常、尿常規異常等情況。

3 討論

針對乙肝肝硬化的病機變化,徐光福教授結合多年的臨床實踐,創立了“益氣解毒通絡方”,該方將益氣、解毒、通絡合理地組織起來,有所側重,合理用藥,較大的起到了剝繭捋絲又工專力宏的效果。本研究結果表明,益氣解毒通絡顆粒在臨床上可以改善乙肝肝硬化患者的癥狀和體征,降低轉氨酶及升高白蛋白(P<0.001),但在改善肝臟形態方面,短期內未見到明確的效果(超聲和A/G結果P>0.05)。

表1 治療前后癥狀指標積分比較分)

表2 治療前后體征指標積分比較分)

表3 治療前后肝臟超聲積分和肝功能結果比較

血管內皮生長因子(VEGF)是缺氧誘導因子(HIF-1α)激活的一個主要的促血管生成因子。VEGF可誘導基質金屬蛋白酶的表達,降解毛細血管基底膜從而有利于內皮細胞的遷移和趨化;VEGF通過與其受體VEGFR-2結合,以蛋白激酶C途徑(不依賴于Ras)激活細胞外信號調節激酶(ERK)通路促進內皮細胞增殖[12]。VEGF是肝臟病理性血管生成的重要啟動因子之一,抑制應力纖維帶形成[13],在與血管外基質降解和SEC形態學改變相關的血管生成早期階段發揮關鍵作用。而且J Siedlecki等的研究亦認為長期抑制VEGF的生成有助于減少親纖維性細胞的形成,有利于改善組織器官的纖維化進展[13]。血小板衍生生長因子(PDGF)由二硫鍵連接的同源二聚體或異源二聚體組成,其受體(PDGF-βR)屬受體酪氨酸激酶家族。PDGF受體結合配體后,胞內結構域酪氨酸殘基自身磷酸化將信號傳入胞內,進而激活下游級聯反應。PDGF是一有效的血管生成趨化因子,對周細胞募集有促進作用。在肝臟血管生成中,SEC分泌的PDGF能夠誘導并募集表達其受體的肝星狀細胞至新生血管周圍,使其穩定成熟從而轉變為具有正常功能的血管[14]。PDGF是由A,B2種單體構成的二聚體結構,可以形成PDGF-AA,PDGF-AB,PDGF-BB 3種形式,在人類血小板來源的PDGF中,約85%～90%為AB型[15-16]。在對腫瘤患者癌細胞的研究中發現癌組織中VEGF和PDGF存在高表達,可用于腫瘤的預后評估和療效的監測[17];在對腫瘤的抗血管生成治療中發現,單一抑制VEGF信號轉導的長期療效不佳,且易產生腫瘤耐藥,而在阻斷VGEF和促進PDGF分泌后療效明顯改善[18-19]。因此以抑制病理性血管生成來抗肝硬化的有效治療也應是多途徑和多靶標的;血管生成對于肝組織的損傷恢復也是必需的,因此需要在拮抗病理性血管生成的同時應能夠控制正常功能的血管再生程度,以延緩肝硬化的進展甚至促進肝臟形態的好轉。

而本研究中,肝臟病理性血管生成的重要啟動因子之一的血清VEGF水平:乙肝肝硬化患者用中藥治療前較健康者輕度升高,治療后較治療前及健康者均有所下降,雖然組間比較差異無統計學意義(P>0.05),但從濃度值來看益氣解毒通絡顆粒在抑制病理性血管生成方面有一定的作用;能夠誘導并募集表達其受體的肝星狀細胞至新生血管周圍,使其穩定成熟從而轉變為具有正常功能血管的血清PDGF-AB水平:乙肝肝硬化患者治療前較健康者顯著降低(P<0.001),雖然中藥干預后仍低于健康者(P<0.05),但中藥干預后較干預前有所升高(P<0.05),說明益氣解毒通絡顆粒有促進肝臟的正常功能血管生成的作用。

由上我們可以得出,益氣解毒通絡顆粒能夠治療乙肝肝硬化,其作用機制可能是通過抑制血清VEGF濃度和促進PDGF-AB濃度的升高,從而在拮抗病理性血管生成的同時,能夠控制正常功能的血管再生程度,以延緩肝硬化的進展甚至促進肝臟形態的好轉,具體作用環節還需進一步研究。目前在臨床中我們觀察中醫藥治療肝硬化的效果,只能通過肝穿刺和影像學的檢查來實現,但是肝穿刺創傷性較大且單個肝組織活檢標本不一定能全面反映肝臟整體纖維化程度,亦不便于門診應用;而影像學的檢查在短期的治療時間段內是看不出明顯變化的。如若能通過動態觀察肝星狀細胞表達的促血管生成的關鍵因子VEGF和PDGF的變化來客觀衡量肝硬化藥物治療的微觀效果,那么在臨床中會極大的提高患者治療的依從性,從而獲得較大的臨床收益。