復發性自然流產胎兒絨毛染色體微陣列芯片327例分析

程丹 楊菁 李潔 張營 陳嬌

復發性自然流產（RSA）是指女性與同一性伴侶發生的2次或2次以上的自然流產，發生率約為1%～5%[1]。RSA一直是妊娠相關疾病中攻而不克的難題，其中約60%的患者自然流產原因不明，稱為原因不明復發性流產（URSA）。既往研究報道半數以上的自然流產，尤其是孕12周前的早期妊娠流產，為胎兒染色體異常導致[2]。目前，胎兒染色體異常的類型及其產生的原因相關研究較少。近年來，針對流產絨毛組織開展的染色體微陣列分析（CMA）被廣泛應用于臨床[3]。CMA對探尋RSA病因和對后續生殖干預的價值一直是爭論的焦點問題。為此，本研究收集了因RSA行絨毛CMA的327例患者，探討流產胎兒染色體核型與母體狀況和RSA的關系，現報告如下。

對象與方法

一、研究對象

選取2016年1～12月因RSA在我科就診，并要求行絨毛CMA的患者為研究對象，納入標準：①既往曾發生2次或以上的孕12周前自然流產；②本次超聲確診胚胎停育或難免流產；③停經45～80 d；④要求行絨毛CMA芯片檢測。排除標準：①夫妻雙方染色體核型異常；②孕期有明確的感染性疾病病史；③女方有嚴重的系統性疾病；④合并子宮肌瘤、子宮畸形等子宮異常患者。本研究經武漢大學人民醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者均簽署臨床研究知情同意書。

二、方 法

1.主要試劑及儀器

Agilent寡核苷酸基因組雜交（CGH）試劑盒，北京博爾城科技全基因組DNA提取試劑盒，QIA?GEN自動DNA提取儀，Thermo CO2培養箱，Olym?pus CX31生物顯微鏡，Cyto Scan HD基因芯片試劑盒及Affymetrix基因芯片雜交儀，Clontech DNA擴增試劑盒。

2.流產胎兒絨毛基因組DNA提取

清宮術后征得患者及其家屬書面同意，留取約直徑2 cm流產胎兒絨毛組織，用無菌生理鹽水漂洗3～5次，48 h內用全基因組DNA提取試劑盒提取DNA，所取DNA經檢測濃度與純度符合標準后置于-20℃保存備用。同時將母體外周血2 ml置于EDTA抗凝管，4℃保存，使用自動DNA提取儀提取DNA，與絨毛提取DNA進行比對以排除母體污染。

3.流產胎兒絨毛CMA檢測

采用美國Affymetric公司的CytoScanHD基因芯片，嚴格按照說明書進行標準化操作，將提取的絨毛基因組DNA，稀釋后取5μl加入NspⅠ酶消化后，末端補齊后連接上共同引物，PCR擴增純化，產物通過片段化酶片段化，連接生物素標記，雜交混勻變性后加載于芯片上，置于雜交儀中50℃雜交16～18 h，沖洗、染色后掃描，獲取數據用于結果分析。

4.數據分析

CMA檢測結果應用美國Affymatrix公司配套的染色體分析套件（Chas）3.1進行數據歸化和結果分析。對在疾病數據庫中報道的染色體變異，歸為致病性的變異；在正常的染色體多態性數據庫中有相符合的染色體變異，歸為正常染色體多態性。同時收集患者年齡、孕產史、BMI等資料，根據患者的年齡分為＜35歲組和≥35歲組，根據患者BMI分為＜18.5 kg/m2組、18.5～24.9 kg/m2組和＞24.9 kg/m2組，分別比較不同年齡組及不同BMI組患者的流產胎兒染色體異常率[4]。

三、統計學處理

所有數據采用SPSS 18.0分析。經正態性檢驗后，非正態分布的計量資料用中位數（上、下四分位數）表示；計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、327例RSA患者的臨床資料分析

327例RSA患者的年齡19（21，44）歲，自然流產3（2，6）次，有正常妊娠史66例（20.2%），其中45例有早期妊娠人工流產史，有正常分娩史17例，既有人工流產史也有正常分娩史并出現2次以上的自然流產4例。

二、CMA結果分析

327例流產胎兒絨毛CMA結果中，正常169例（51.7%），異常158例（48.3%）。158例異常者中，染色體數目異常占84.8%，結構異常占15.2%。染色體數目異常中最多見為三體綜合征，其次為X染色單體。染色體結構異常中多見染色體微重復和微缺失，見表1。

表1 158例異常胎兒染色體的類型分布

三、不同年齡、BMI的RSA患者間胎兒染色體異常率及分型比較

年齡≥35歲的RSA患者胎兒染色體異常率高于年齡＜35歲者（P＜0.01），2組異常染色體分型間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。不同BMI患者間胎兒染色體異常率及分型比較差異均無統計學意義（P均＞0.05），見表2。

表2 不同年齡、BMI的RSA患者間胎兒染色體異常率及分型比較 例（%）

討 論

RSA是難治性的生育障礙，發病率為1%～5%。偶發性自然流產可看作在配子形成及胚胎發育過程出現的隨機錯誤事件，屬自然淘汰過程，但2次以上自然流產者的再次妊娠流產發生率上升3倍，3次后再發風險高達80%[5]。RSA對育齡婦女造成嚴重的身心傷害，大大增加患者心理和精神負擔[6]。

RSA的病因復雜，半數以上的流產是由于胚胎或胎兒的染色體異常，進行染色體檢查非常必要[7]。2%～5%的夫婦染色體正常，但妊娠后可能產生一個染色體重排的不平衡胚胎，因此雙親染色體核型分析并不能取代胎兒染色體核型分析[8]。對流產胎兒行染色體檢查可以判斷流產原因是否為胎兒染色體異常，對RSA夫婦的遺傳咨詢和指導再次妊娠有重要意義。

Gonzales等[9]分析了流產胚胎染色體異常類型的頻率，結果顯示48%的早期自然流產胚胎染色體異常，Huang等[10]研究報道流產胚胎中染色體非整倍體的發生率是34.7%。本組資料中胎兒異常比例為48.3%，與既往報道相近。

自然流產中的染色體異常80%以上為數目異常，尤其以非整倍體的發生最多見，包括三體、單體及多倍體等[11]。染色體的非整倍體被認為是造成人類胚胎這種低著床率和早期丟失的一個重要原因。本研究也證實了這一現象，染色體數目異常占84.8%，尤其是各種三體綜合征比較多見。三體通常是母體減數分裂中同源染色體不分離，導致子細胞中染色體的重復。本研究中，染色體三體發生率從高至低依次為18、16、21、22、15號，個別次序不同可能是樣本量不足的偏倚。X連鎖染色體滅活與不明原因RSA有關。胚胎X性染色單體通常是卵子或精子受精過程出現分離錯誤導致的[12]。染色體核型為（45，XO）即Turner綜合征，是僅次于三體綜合征的一類染色體異常，本研究中其發生率為16.5%。常染色體出現單體的情況較少，本研究中僅2例21單體，發生率為1.3%。另一類比較常見的染色體數目異常為多倍體，如三倍體或四倍體，本研究中的發生率為10.8%。三倍體通常是由于雙精入卵或卵子在母體減數分裂過程中不分離而直接受精導致，四倍體可能是由于受精卵有絲分裂不分離導致。因為非整倍體流產大多偶然發生，患者預后通常較好，在隨后的妊娠中可能獲得正常胎兒。反復發生的胎兒異常還可通過胚胎植入前遺傳學篩查（PGS）篩選正常胚胎，避免反復流產所致的精神和身體創傷[13]。

胚胎單純的染色體數目異常，夫婦再發風險一般相對較低，而染色體結構異常胚胎，往往提示夫婦染色體異常攜帶可能較大，再發風險也較高[14?15]。本研究顯示，染色體結構異常24例，這種微變異常規染色體核型分析易漏診，而夫婦可能攜帶有類似片段異常但未出現相關表型或癥狀較輕。

孕婦年齡也是胚胎染色體異常的重要因素，隨著年齡增加，染色體發生異常風險增加，尤其三體綜合征，可能由高齡孕婦卵母細胞暴露于有害環境機會增加，以及卵子老化引起染色體減數分裂不分離現象導致[16]。本研究顯示，年齡≥35歲的RSA患者胎兒染色體異常率高于年齡＜35歲者，說明女性在35歲以后開始出現明顯的卵巢老化與卵母細胞分裂異常。本研究亦通過對患者BMI進行分層分析，結果顯示BMI＜18.5、18.5～24.9、＞24.9 kg/m2者的胎兒染色體異常率組間比較差異無統計學意義，可能跟樣本例數較少有關，值得臨床進一步關注。

絨毛細胞是胚胎外胚層細胞，具有與胎兒組織相同的遺傳性狀，利用絨毛細胞檢測胎兒染色體是細胞遺傳學研究的主要方法，常用的方法包括G顯帶染色體核型分析與熒光原位雜交（FISH）等。其中G顯帶是比較經典傳統的方法，費用低廉，可以準確檢測流產組織的染色體核型，缺點在于需要對所獲得的胎兒絨毛進行細胞培養，無菌要求高，容易污染，尤其是胚胎停育時間較長的流產物，絨毛中活細胞數少，培養失敗比例高。G顯帶染色體核型分析的局限性還在于不能分辨長度在10 Mb以下片斷的缺失、重復或易位，而且對染色體亞端粒區域異常診斷率較低，染色體異常漏診率可高達10%[17]。FISH通過特異性的探針能夠快速診斷染色體數目異常，可大大提高診斷精度，而且對標本要求較低，不僅可以檢測處于細胞分裂中期的活細胞，對于細胞間期的無活性或污染的標本也能檢測，也無需進行細胞培養。但FISH的缺點是只能利用特異的探針，檢測特定的5～12條染色體，不能覆蓋全基因組，尤其對背景未知的基因引發的疾病無法檢測。其他方法包括基于毛細管電泳檢測的熒光定量PCR或多重連接依賴探針擴增等，這些方法僅能針對一定數目的片段進行分析，存在局限性[18]。

近年發展起來的CMA技術是通過對所有染色體中的基因進行掃描[19?20]。本研究采用Affymetrix公司的Cyto Scan HD芯片，在高密度優化的單核苷酸多態性（SNP）探針基因分型芯片基礎上加入了拷貝數目變異（CNV）探針，同時檢測片段的SNP、CNV及雜合性缺失（LOH），不僅能在整個基因組范圍內準確地檢測出50 kb以上的染色體不平衡，分析嵌合型、三倍體等，還能檢測出額外的5%亞微觀染色體變異與失衡[21]。與傳統的G顯帶染色體核型分析和FISH檢測相比，CMA技術不僅具有高通量、高分辨率和高自動化檢測的優勢，還能克服母源污染和培養失敗，提高異常核型的檢出率，已被我國兒科協會和產前診斷協會分別推薦用于兒科遺傳病及產前診斷。值得關注的是，CMA也存在一定的局限性，它無法檢測到染色體平衡性重排，也不能檢出所有的CNV，如1、9、16及Y染色體次縊痕區域和D組、E組染色體短臂等區域，對于低于檢測分辨率的CNV、單基因遺傳病的點突變異常、基因表達異常和甲基化異常也無法檢出[22]。把CMA與流式細胞儀、小隨體基因分型或與分裂中期FISH相結合，可以彌補CMA技術缺陷，但是費用較高。

Lo等[23]報道，在常規染色體核型分析正常，但超聲發現胎兒結構異常的病例中病理性CNV檢出率為6.5%，高齡孕婦CMA陽性率是1.0%。本研究中有3例檢出微缺失，2例檢出微變異，占全部異常病例的5.2%。目前對亞微觀染色體變異與失衡是否是導致流產直接原因的觀點并不一致。有學者認為，這種染色體亞微觀變異為單純多態性，在正常人群中也可發生。多數研究認為，雖然染色體微失衡并不直接改變整個基因編碼區，但可能改變涉及區域內覆蓋的基因結構，影響基因的表達[24]。染色體微變異部分還可造成同源染色體配對困難，遺傳物質重復或缺少，從而影響細胞分裂，可能是妊娠失敗的原因。

染色體數目異常相關的自然流產，與父母雙方染色體無關，再發流產風險相對較低；染色體結構異常導致的流產，可能與父母染色體異常攜帶相關，其再發風險也較高[25]。因此對于此類型的流產，雖然父母雙方常規染色體核型分析正常，仍建議診斷異常片段進行更高精度的染色體結構分析，以評價對后續妊娠可能的影響。本研究顯示，大部分染色體異常為數目異常，327例URSA患者中結構異常僅24例，約15.2%，主要包括染色體的微重復、微缺失和微變異，這些異常可能與胚胎停育相關，夫婦可能攜帶有類似片段異常，由于其遺傳外顯率不全、表現度差異及性連鎖隱性遺傳等因素影響而未出現相關表型或癥狀較輕。

綜上所述，RSA患者的胎兒染色體異常率高，對胎兒進行染色體分析對后續的妊娠指導至關重要，胎兒染色體異常大多數為數目異常，流產絨毛組織的CMV具有獨特的高分辨率、高靈敏度和特異度，并且能夠精確定位，CMV在染色體病的基因型?表型關系診斷具有較高的應用價值。