γ-聚谷氨酸固態發酵提取液的脫色研究

◎ 歐詩亮，王永東，鄒水洋

（東莞理工學院應用化學系，廣東 東莞 523808）

γ-聚谷氨酸（γ-poly glutamic acid，γ-PGA）作為一種新型的可生物降解高分子材料，因其強吸水性、免疫原性、高成膜性和生物組織相容等良好性能[1]，具有廣闊的應用前景。

γ-PGA常用的生產方法是微生物發酵法。成品γ-PGA是白色晶體或粉末狀，而發酵液會帶有一定的顏色，因此在醇析提取之前必須通過各種手段去除色素。色素的來源既有原料本身，也有殺菌和發酵過程中產生的。由于培養基中含有大量谷氨酸、多肽以及蛋白質，很容易與還原糖發生美拉德反應產生褐變[2]；基于γ-PGA發酵液中菌體含量高，黏度大，色素成分復雜使得脫色較為困難且產物損失大。所以脫色工藝是γ-PGA生產中必須高度重視的關鍵環節。目前脫色主要采用大孔吸附型樹脂、離子交換樹脂、活性炭粉、活性炭顆粒、硅藻土等吸附劑，然而這些物質脫色吸附的同時也降低了產物的含量[3]。因此，本文擬考察多種吸附劑及其脫色工藝條件對產品脫色率和回收率的影響以獲取優化的脫色工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

豆芽汁：大豆芽（市售）0.5 kg，加水2.5 kg，煮沸，濃縮至1 000 mL，過濾待用；種子液培養基：100 mL豆芽汁，5 g蔗糖，pH自然；大豆水解液：50 g干黃豆打碎成粉末，以1∶10的比例加入500 mL蒸餾水，加熱煮沸過濾得大豆漿液，降至室溫加入5 g堿性蛋白酶，調節pH 9.5、60 ℃水浴攪拌2 h，再加熱煮沸2 min滅活酶；固體發酵培養基：將大豆水解液（加入葡萄糖1%和5%的谷氨酸鈉，調pH7.0）與麩皮按照1∶1的比例攪拌均勻，250 mL錐形瓶裝料量20 g，110 ℃滅菌20 min。活性炭，東莞洪笙活性炭有限公司；活性白土，樂平市潔凈漂白土有限公司；凹凸棒黏土（江蘇奧特邦非金屬礦業有限公司）；谷氨酸鈉（≥99%），廣州奧桑味精食品有限公司；γ-PGA（化妝品級），山東福瑞達生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），中國工業微生物菌種保藏中心（CICC20645）；堿性蛋白酶（200 000 U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2 實驗儀器

YM-50 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海三中醫療器械有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司；HQL300B 柜式恒溫冷凍搖床：武漢中科科儀技術發展公司；BCD-256KFA 冰箱：青島海爾股份有限公司；TDL-5-A多管離心機：上海安亭科學儀器廠；SW-CJ-1F凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 γ-PGA發酵提取液的制備

取斜面種子接種于種子液培養基，37 ℃、120 r/min恒溫培養24 h即為種子液。將種子液按8%接種量接種于固體發酵培養基，37 ℃恒溫靜置培養48 h。加10倍重量的蒸餾水于固體發酵物中，28 ℃攪拌（200 r/min）1 h，然后用2層紗布過濾，濾液5 000 r/min離心20 min，取上清液（發酵提取液）待用。

1.3.2 γ-PGA發酵提取液的脫色

250 mL燒杯中加入100 mL發酵提取液，調節pH，加入一定量的活性炭（或其他吸附劑）攪拌混勻，水浴保溫一定時間，然后離心分離（5 000 r/min，20 min），取上清液測660 nm處吸光度和γ-PGA的濃度。

1.3.3 活性炭脫色正交實驗設計

由于活性炭是最常用的脫色吸附劑，因此先用正交實驗優化其脫色工藝。通過預實驗初步確定了其影響因素及作用范圍為：溫度40～60 ℃、時間0.5～2 h、pH 4～6、加活性炭量20～30 g/L，選擇L9（34）正交表設計正交試驗。正交試驗因素及水平見表1。

表1 活性炭脫色正交實驗設計表

1.3.4 活性炭不同預處理方法對γ-PGA脫色效果的影響

活性炭按30 g/L的標準用量，分別采用以下不同預處理方法：①加入1 mol/L鹽酸100 mL，60 ℃水浴3 min，離心去上清液，用蒸餾水多次洗滌至中性，烘干。②熱水煮沸30 min，離心去上清液，烘干。③不進行預處理的活性炭作為對照。將以上3種活性炭分別對發酵液進行脫色實驗。

1.3.5 微晶纖維素與活性炭協同對γ-PGA脫色效果的影響

在100 mL發酵提取液中先加入3.0 g活性炭，再分別加入0～7.5 g微晶纖維素，對照組僅加入3.0 g微晶纖維素，攪拌混勻后于水浴60 ℃保溫1 h，5000 r/min離心20 min，取上清液分別測定吸光度和γ-PGA的濃度。

1.3.6 不同吸附劑合用對γ-PGA脫色效果的比較

在正交試驗優化發酵提取液純化工藝的條件下，進一步探討活性炭與其他吸附劑聯合使用對脫色效果和γ-PGA回收率的影響。單一吸附劑脫色實驗中各種吸附劑用量均為30 g/L，兩種吸附劑混合脫色或先后脫色實驗中各種吸附劑用量均為15 g/L。

1.4 測試方法

（1）γ-PGA含量的測定。用CTAB比濁法測定γ-PGA的含量[4]。

（2）γ-PGA發酵提取液色度的測定。將脫色前后的γ-PGA發酵提取液用蒸餾水稀釋10倍，以蒸餾水作參比調零，在660 nm波長下，使用紫外分光光度計分別測定脫色前后的發酵提取液的吸光度，計算得每種脫色方案的脫色率。計算公式：

2 結果與討論

2.1 正交試驗的優化結果分析

根據單因素試驗確定的溫度、pH、保溫時間及活性炭添加量，利用L9（34）正交表建立的正交試驗方案及實驗結果見表2。

表2 L9（34）正交表建立的正交試驗方案及實驗結果分析表

對表2中的脫色率進行統計分析，通過R值分析可知，對脫色效果的影響因素顯著性排序為脫色時間＞活性炭用量＞pH＞脫色溫度。對K值的分析比較可知優化的脫色工藝條件是A2B2C3D3，即為溫度50 ℃、pH 5、時間2 h、活性炭用量30 g/L；同時，優化工藝條件后的實驗操作結果也驗證了正交實驗設計理論的正確性，其脫色率較高，為83.37%。因此，發酵液脫色的最優工藝為活性炭添加量30 g/L、脫色時間2 h、pH為5、溫度50 ℃。

2.2 不同預處理的活性炭的影響

如表3所示，鹽酸預處理的活性炭脫色效果顯著，高達92.14%，但對γ-PGA的回收率很低，只有11.78%。經鹽酸預處理的活性炭脫色效果提高的原因可能是鹽酸溶解了活性炭中大量的無機成分，增加了內部孔隙率，并使活性炭上的一些活性基團得以自由，從而增強其吸附性能。但活性炭較大的孔隙會增加其對大分子的吸附，導致γ-PGA損失嚴重。開水煮沸的和不進行預處理的活性炭無論從脫色率和γ-PGA的回收率來看，效果相差無幾，雖然其脫色效果低于鹽酸處理后的活性炭，但γ-PGA的損失相對較小，為減少工藝環節，后續實驗仍以不經任何預處理的活性炭進行脫色實驗。

表3 活性炭不同的預處理方式對脫色效果的影響表

2.3 微晶纖維素添加量的影響

微晶纖維素是天然纖維素經稀酸水解至極限聚合度的可自由流動的極細微的短棒狀或粉末狀、多孔狀顆粒，可用作吸附劑。為提高γ-PGA發酵提取液的脫色效果，嘗試用微晶纖維素和活性炭混合使用作為脫色劑，實驗結果如圖1所示。微晶纖維素和活性炭混合使用較單獨使用活性炭或微晶纖維素能一定程度提高脫色效果，其中微晶纖維素添加量為35 g/L時表現最佳，脫色率達87.90%，γ-PGA回收率達44.41%。但總的來看，微晶纖維素增效作用不大，產物回收率不高，過多微晶纖維素的加入使產物回收率顯著降低。

圖1 微晶纖維素的添加量對活性炭脫色的影響圖

2.4 不同吸附劑合用脫色效果的比較

活性白土、凹凸棒黏土是常用的無機吸附劑和絮凝劑，在研究中發現，活性白土、凹凸棒黏土對發酵提取液的色素吸附有一定效果，尤其能降低發酵液濁度（具有澄清溶液的作用）。因此嘗試將活性白土、凹凸棒黏土與活性炭聯合使用來考察它們對γ-PGA發酵提取液的脫色效果，實驗結果如表4所示。

表4 不同吸附劑及作用方式的脫色效果及產物回收率表

由表4可知，不同吸附劑及作用方式對發酵提取液的脫色效果和γ-PGA的回收效果有顯著影響。單獨使用活性白土或凹凸棒黏土脫色效果不及活性炭。將活性炭分別與活性白土或凹凸棒黏土減半后混合使用，脫色率及回收率均比單獨使用有所提高，但效果還不夠理想；活性炭與活性白土混合使用能使脫色率達到92.12%，效果很好，但γ-PGA回收率仍處于較低水平，只有60.87%。如將活性炭分別與活性白土或凹凸棒黏土按先后次序聯用，脫色率分別為90.76%、92.53%，γ-PGA回收率分別為82.40%、88.20%，較混合使用的處理效果明顯提高，且達到較理想的水平。

不同吸附劑對色素物質的選擇吸附能力各不相同，雖然活性炭對發酵提取液的脫色效果較好，但對γ-PGA的吸附作用也很強，活性炭用量過大容易造成γ-PGA的損失。而活性白土和凹凸棒黏土的脫色效果雖然比活性炭低，但對色素物質的選擇性吸附使之與活性炭形成一定程度的互補作用，因而與活性炭聯合使用（混合或串聯）能有效提高脫色率。賀楊揚等[5]人的研究指出，硅藻土吸附劑形成的濾餅層有利于γ-PGA發酵液中菌體截留和雜蛋白吸附。活性白土和凹凸棒黏土也有類似助濾作用，這是其降低發酵液濁度的重要原因。另外，發酵液的濁度和吸附劑用量對吸附過程影響復雜，過高的發酵液濁度及吸附劑用量會降低吸附劑的選擇性，γ-PGA發酵液中如存在較多的吸附劑（單獨或混合）會導致γ-PGA的較大損失。因此，本實驗將活性炭分別與活性白土、凹凸棒黏土在較低用量下按先后次序串聯使用的方法既利用了不同吸附劑之間的互補性，又避免了過高濃度的吸附劑對目標產物的無選擇吸附，使脫色率和產物回收率均達到了較理想水平，具有潛在的實用價值。

3 結論

通過正交試驗優化γ-PGA發酵提取液脫色工藝條件如下：溫度50 ℃、pH為5、時間2 h、活性炭添加量為30 g/L時，γ-PGA發酵液的脫色效果最好，脫色率達83.37%。將15 g/L活性炭分別與15 g/L活性白土、凹凸棒黏土按先后次序對γ-PGA發酵提取液進行脫色處理能達到良好的脫色效果和較高的產物回收率，其中活性炭與凹凸棒黏聯用的脫色率和產物回收率分別達到92.53%、88.20%。該方法既利用了不同吸附劑之間的互補性，又避免了吸附劑的過高濃度對目標產物的無選擇吸附，為γ-PGA發酵提取液的脫色工藝提供了新的思路。