苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測(cè)定麥冬中麥冬多糖含量的比較研究

◎ 張 妍，劉太林

（天津天獅學(xué)院，天津 301700）

麥冬 [Ophiopogon japonicas （Thunb.） Ker-Gawl]為百合科沿階草屬多年生植物麥冬的干燥肉質(zhì)塊莖，主要分布于四川、浙江及江蘇一帶[1-3]。《本草匯言》中記載：麥門冬，味甘、微苦，性微寒，歸心、肺、胃經(jīng)，可為清心潤(rùn)肺之藥，常與其他中藥配伍，用于治療肺燥干咳、津傷口渴，心煩失眠、內(nèi)熱消渴以及腸燥便秘等[4]。麥冬的有效成分包括甾體皂苷、多糖、異黃酮和氨基酸等，其中麥冬多糖含量較高，其藥理作用主要表現(xiàn)為抗腫瘤、抗心肌缺血、抗氧化、抗過(guò)敏、降低血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫、潤(rùn)肺平喘并保護(hù)外分泌腺等[5-8]。植物多糖的測(cè)定方法主要包括苯酚-硫酸法[9-11]、蒽酮-硫酸法[12-14]、還原糖測(cè)定法[15-16]、高效液相色譜法[17-18]、酶法[19-20]等，當(dāng)前文獻(xiàn)報(bào)道植物多糖測(cè)定方法以苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法較為多見。本文分別采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法測(cè)定麥冬中麥冬多糖含量，并對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行比較分析，為確定合理的麥冬多糖含量測(cè)定方法提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

麥冬為市售藥材；無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司（純度≥98%）；蒽酮：上海國(guó)藥試劑集團(tuán)；苯酚、濃硫酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠（分析純）；無(wú)水乙醇（分析純）：天津市匯杭化工科技有限公司。

UV-2500型紫外可見分光光度計(jì)：島津儀器有限公司；100～1 000 μL、1 000～5 000 μL移液器：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BSA124S型精密分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；WE-1型水浴恒溫振蕩器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DH-101-3BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；TD5K-Ⅲ型低速離心機(jī)：長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)溶液的配制

2.1.1 麥冬多糖溶液的制備

麥冬干燥后粉碎過(guò)80目篩，精密稱取2 g麥冬粉末并加入50倍量純化水，于70 ℃、振蕩頻率100 r/min條件下水浴振蕩提取2 h，過(guò)濾除去藥渣后減壓濃縮至濃稠，加入8倍量冷無(wú)水乙醇靜置過(guò)夜，離心取下層多糖稠膏，加入適量水溶出并定容至100 mL搖勻，再稀釋250倍后搖勻得到麥冬多糖溶液。

2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用蒸餾水定容至50 mL中，得到0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液。分別量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.8 mL和1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液置于10 mL容量瓶中稀釋至刻度線，搖勻，即為濃度10、20、30、40、80 μg/mL和100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.3 苯酚溶液的制備

稱取苯酚100 g，加0.1 g鋁片和0.05 g碳酸氫鈉常壓蒸餾，收集（180±2）℃餾分[13]。精密稱取餾分10 g，加蒸餾水定容至100 mL搖勻置于棕色試劑瓶中冰箱保存。

2.1.4 蒽酮-硫酸溶液的制備

精密稱取0.5 g蒽酮，溶解于100 mL濃硫酸中，置于棕色試劑瓶中冰箱保存（臨用現(xiàn)配）。

2.2 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量

2.2.1 反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)的確定

分別精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與麥冬多糖溶液2 mL置于比色管中，室溫下分別加入6%苯酚溶液1 mL搖勻，緩慢加入濃硫酸5 mL，混勻后置于50 ℃條件下水浴顯色20 min，流水冷卻至室溫，在400～700 nm波長(zhǎng)區(qū)域掃描吸收曲線。

2.2.2 苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

取樣品溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，室溫下加入濃度分別為3%、4%、5%、6%和8%苯酚溶液1 mL搖勻，緩慢加入濃硫酸5 mL，混勻后置于50 ℃水浴顯色20 min，流水冷卻至室溫，在490 nm處測(cè)定其吸光值，計(jì)算多糖含量。

2.2.3 濃硫酸用量的確定

取樣品溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，室溫下加入6%苯酚溶液1 mL搖勻，分別緩慢加入濃硫酸4、5、6、8 mL和10 mL，混勻后置于50 ℃條件下水浴顯色20 min，流水冷卻至室溫，在490 nm處測(cè)定其吸光值，計(jì)算多糖含量。

2.2.4 反應(yīng)溫度的確定

取樣品溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，室溫下加入6%苯酚溶液1 mL搖勻，緩慢加入濃硫酸5 mL，混勻后分別置于30、40、50、60 ℃和70 ℃條件下水浴顯色20 min，流水冷卻至室溫，在490 nm處測(cè)定其吸光值，計(jì)算多糖含量。

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間的確定

取樣品溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，室溫下加入6%苯酚溶液1 mL搖勻，分別緩慢加入濃硫酸5 mL，混勻后置于50 ℃條件下水浴分別顯色10、15、20、25 min和30 min，流水冷卻至室溫，在490 nm處測(cè)定其吸光值，計(jì)算多糖含量。

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取各濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，按照上述試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳試驗(yàn)條件參數(shù)，在490 nm處分別依次測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.7 方法學(xué)指標(biāo)的考察

取麥冬多糖溶液，按照上述試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳試驗(yàn)條件參數(shù)，分別依次進(jìn)行該方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及加樣回收率的考察。

2.2.8 麥冬多糖含量的測(cè)定

取麥冬多糖溶液，按照上述試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳試驗(yàn)條件參數(shù)，測(cè)定其吸光值，通過(guò)線性回歸方程計(jì)算麥冬多糖含量。

2.3 蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖含量

2.3.1 反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)的確定

分別精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與麥冬多糖溶液2 mL置于比色管中，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL搖勻，混勻后沸水浴中顯色15 min，迅速置于冰水中冷卻，在400～700 nm波長(zhǎng)區(qū)域掃描吸收曲線。

2.3.2 蒽酮-硫酸溶液用量的確定

取樣品溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸餾水作為空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液2、3、4、5 mL和6 mL搖勻，混勻后沸水浴中顯色15 min，迅速置于冰水中冷卻，在620 nm處測(cè)定其吸光值，計(jì)算多糖含量。

2.3.3 反應(yīng)溫度的確定

取樣品溶液2 mL置于比色管中，以2mL蒸餾水作為空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL搖勻，混勻后分別置于60、70、80、90 ℃和100 ℃水浴中顯色15 min，迅速置于冰水中冷卻，在620 nm處測(cè)定其吸光值，計(jì)算多糖含量。

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間的確定

取樣品溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸餾水作為空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL搖勻，混勻后沸水浴中分別顯色10、15、20、25 min和30 min，迅速置于冰水中冷卻，在620 nm處測(cè)定其吸光值，計(jì)算多糖含量。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取各濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，按照上述試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳試驗(yàn)條件參數(shù)，在620 nm處分別測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.6 方法學(xué)指標(biāo)的考察

取麥冬多糖溶液，按照上述試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳試驗(yàn)條件參數(shù)，分別進(jìn)行該方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及加樣回收率考察。

2.3.7 麥冬多糖含量的測(cè)定

取麥冬多糖溶液，按照上述試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳試驗(yàn)條件參數(shù)，測(cè)定其吸光值，通過(guò)線性回歸方程計(jì)算麥冬多糖含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法最大吸收波長(zhǎng)的比較

采用兩種方法分別對(duì)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和麥冬多糖溶液進(jìn)行處理，經(jīng)UV-2500紫外可見分光光度計(jì)掃描其在波長(zhǎng)400～700 nm區(qū)域的最大吸收波長(zhǎng)，其波長(zhǎng)曲線如圖1、圖2所示。A曲線表示苯酚-硫酸法，B曲線表示蒽酮-硫酸法。

圖1 葡萄糖溶液吸收波長(zhǎng)比較圖

圖2 麥冬多糖溶液吸收波長(zhǎng)比較圖

由圖1和圖2可見，采用苯酚-硫酸法測(cè)定時(shí)，葡萄糖和麥冬多糖在488 nm波長(zhǎng)處有明顯的最大吸收峰，其余波段無(wú)干擾峰，表明麥冬多糖在苯酚-硫酸作用下生成絡(luò)合衍生物組分單一，顯色效果良好。采用蒽酮-硫酸法測(cè)定時(shí)，葡萄糖和麥冬多糖在400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收波長(zhǎng)變化較大，在620 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)較大吸收峰，但與苯酚-硫酸法相比，最大吸收峰穩(wěn)定性較差，且存在干擾峰，測(cè)定方法準(zhǔn)確性不高。

3.2 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法最佳條件的確定

3.2.1 苯酚-硫酸法最佳條件的確定

苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)、濃硫酸用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)麥冬多糖吸光度值的影響如圖3所示。綜合考慮，苯酚-硫酸法測(cè)定麥冬多糖含量最佳條件為苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù) 6%、硫酸用量5 mL、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間20 min。

圖3 4種因素對(duì)吸光度值的影響圖

3.2.2 蒽酮-硫酸法最佳條件的確定

蒽酮-濃硫酸溶液用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)麥冬多糖吸光度值的影響如圖4所示。綜合考慮，蒽酮-硫酸法測(cè)定麥冬多糖含量最佳條件為蒽酮-硫酸用量4 mL、反應(yīng)溫度100 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min。

圖4 3種因素對(duì)吸光度值的影響圖

3.3 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的比較

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示。采用苯酚-硫酸法所得回歸方程為y=27.011x-0.0964（R2=0.999 1），在10～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，而采用蒽酮-硫酸法所得回歸方程為y=22.929x-0.0513（R2=0.996 4），與苯酚-硫酸法相比，在10～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性較差。

圖5 兩種方法測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較圖

3.4 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法方法學(xué)指標(biāo)的比較

3.4.1 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法精密度的比較

如表1所示，苯酚-硫酸法測(cè)定麥冬多糖的精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.58%，小于蒽酮-硫酸法的測(cè)定結(jié)果1.96%，故苯酚-硫酸法的精密度略優(yōu)于蒽酮-硫酸法。

表1 兩種方法測(cè)定麥冬多糖精密度的比較表

3.4.2 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法重復(fù)性的比較

如表2所示，苯酚-硫酸法測(cè)定麥冬多糖的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.90%，明顯小于蒽酮-硫酸法的測(cè)定結(jié)果3.53%，故苯酚-硫酸法的重復(fù)性優(yōu)于蒽酮-硫酸法。

表2 兩種方法測(cè)定麥冬多糖重復(fù)性的比較表

3.4.3 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性的比較

如表3所示，在0～120 min內(nèi)，苯酚-硫酸法測(cè)定麥冬多糖的穩(wěn)定性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.46%，略大于蒽酮-硫酸法的測(cè)定結(jié)果0.34%，故蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性略優(yōu)于苯酚-硫酸法。

表3 兩種方法測(cè)定麥冬多糖穩(wěn)定性的比較表

3.4.4 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法加樣回收率的比較

如表4所示，苯酚-硫酸法測(cè)定麥冬多糖的加樣回收率為100.63%，優(yōu)于蒽酮-硫酸法的測(cè)定加樣回收率101.67%，且其RSD亦優(yōu)于蒽酮-硫酸法，故苯酚-硫酸法加樣回收率優(yōu)于蒽酮-硫酸法。

表4 兩種方法測(cè)定麥冬多糖加樣回收率的比較表

3.5 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測(cè)定麥冬多糖含量的比較

如表5所示，苯酚-硫酸法測(cè)定麥冬多糖含量為42.96%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.73%，蒽酮-硫酸法測(cè)定麥冬多糖含量為38.56%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.40%。由此看出，苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量高于蒽酮-硫酸法，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也較小，故苯酚-硫酸法優(yōu)于蒽酮-硫酸法。

表5 兩種方法測(cè)定麥冬多糖含量的比較表

4 結(jié)論

本研究以麥冬多糖作為研究對(duì)象，研究比較兩種檢測(cè)方法對(duì)其測(cè)定結(jié)果的影響，并對(duì)兩種方法的檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。苯酚-硫酸法測(cè)定麥冬多糖含量最佳條件為苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、硫酸用量5 mL、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間20 min，測(cè)得麥冬多糖含量為42.96%。蒽酮-硫酸法測(cè)定麥冬多糖含量最佳條件為蒽酮-硫酸用量4 mL、反應(yīng)溫度100 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min，測(cè)得麥冬多糖含量為38.56%。在葡萄糖濃度10～100 μg/mL范圍內(nèi)，苯酚-硫酸法測(cè)定葡萄糖所得標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（R2=0.999 1）大于蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（R2=0.996 4），說(shuō)明苯酚-硫酸法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好。苯酚-硫酸法測(cè)定麥冬多糖精密度RSD為1.58%、重復(fù)性RSD為1.90%、0～120 min內(nèi)穩(wěn)定性RSD為0.46%、加樣回收率為100.63%。蒽酮-硫酸法測(cè)定麥冬多糖精密度RSD為1.96%、重復(fù)性RSD為3.53%、0～120 min內(nèi)穩(wěn)定性RSD為0.34%、加樣回收率為101.67%。

結(jié)果表明：兩種方法均具備操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和條件易于控制等優(yōu)點(diǎn)，均適用于麥冬多糖成分的測(cè)定。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果考慮，相對(duì)于蒽酮-硫酸法，苯酚-硫酸法更加適用于麥冬多糖含量的測(cè)定，且與苯酚-硫酸法相比，蒽酮-硫酸法最大吸收峰穩(wěn)定性較差，且存在干擾峰，測(cè)定方法準(zhǔn)確性較差，故在麥冬中麥冬多糖含量測(cè)定時(shí)可優(yōu)先考慮苯酚-硫酸法。