楊樹銹病病原菌的分子鑒定及防治措施

莫丁山

【摘要】青楊鑄病是互助縣楊樹人工林和天然林的重大病害之一，在純林或落葉松混交林中均普遍發生并造成嚴重的經濟損失，該研究對互助縣南門峽林場楊樹銹病病原菌進行了分子鑒定，為明確其正真的病原菌種類并總結了防治措施。

【關鍵詞】楊樹 銹病 分子鑒定 防治技術

1 病害調查

2015-2017年，在互助縣南門峽林場選取10塊標準地，7～10月每隔1月調查一次青楊銹病發病率與病情指數。標準地的設置為每塊標準地面積約為30×30m₂，每塊標準地內隨機選4～5行青楊，各行再每隔3株選取1株，隨機摘取上、中、下三個部位青楊葉片，總調查30～50株，葉片總數不少于800片；對于散生的青楊，依據實際分布情況隨機選取調查株。青楊銹病病害嚴重度分級參照曹支敏等的分級標準，見表1。

經調查發現，青楊銹病主要危害青楊苗木和新生葉片，導致未成熟芽早落，該病害于5-6月在葉背出現退綠斑點并產生夏孢子堆，并產生桔黃色小泡，破皮后散出黃粉堆，嚴重時黃粉布滿整個葉背，9月，葉正面出現銹紅色斑點，并逐漸變成棕色至褐色的冬孢子堆，葉子提前脫落，樹木長勢變弱易受其它病原物侵染。

2 病原菌分子鑒定

2.1 夏孢子DNA提取

取夏孢子DNA，用滅菌載玻片刮取新鮮夏孢子堆于滅菌研缽中研磨，置于1.5mL離心管內，具體加樣步驟如下：①加20μl的Lysozyme溶液，混合，室溫靜置6min；②加30μl的EDTA Buffer，混合，室溫靜置5min；③加200μl的Solution A，振蕩，65℃保溫10min；④加400μl的Solution B，劇烈振蕩15S；⑤加650μl的So-lution C，混合；12，000rpm離心1min，棄上層，將無色下層移人預先置于1.5ml離心管上的Filter Cup中，12，000rpm離心1min。⑥棄Filter Cup，在濾液中加入450μl的DB Buffer，混合均勻。將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。⑦將上述操作的混合液轉移至Spin Column中，12，000rpm離心1min，棄濾液。⑧將500μl的Rinse A加入至Spin Column中，12，000rpm離心1min，棄濾液。將700μl的Rinse B加入至Spin Column中，12，000rpm離心1min，棄濾液。⑨將Spin Column安置于CollectionTube上，12，000rpm離心1min。⑩將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入60μl的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1min。12，000rpm離心1min洗脫DNA。

2.2 PCR擴增及擴增產物電泳檢測

擴增引物為：ITS1-F和ITS4-B GardesM、B runs T D。

反應體系為：2μL摸板DNA、36.5μL ddH2O、2μL MgCl2（25mm ol L-1）、5μL10×PCR Buffer，0.5μLdNTPS（10mm olL-1）、1μL⑩ITSI-F（10μm of L-1）、1μL ITS4-B（10μm of L-1）、4U Taq酶（生工）。

反應條件：61℃1′15″，93℃1min，55.3℃1′15″，72℃1′30″，30cycles，72℃ 10min，4℃保存。反應前將底物在95℃溫育5min，然后迅速置-20℃保存。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并成像。

2.3 rDNA-ITS序列測序及同源性比對

以夏孢子的ITS1和ITS4區擴增產物進行全序列測定（金唯智生物科技（北京）有限公司），并將獲得的DNA序列在NCBI上進行比對。將rDNA-ITS序列PCR產物進行測序，所得結果比對，結果顯示與Melampsora larici-populina序列同源性為99%。rDNA-ITS序列長度為663bp。基于Nei's（1978）構建無偏遺傳距離的系統樹狀圖，系統樹狀圖顯示實驗種與Melampsora larici-populina（DQ234698） ITS序列聚為一類，同源性為99.8%。明確該菌為落葉松楊柵銹菌（Melampsora larici-populina）。

3 防治技術

青楊林是一個生態經濟系統，對楊樹病害的防治不能孤立地、片面地進行，而應從楊樹林生態系統的總體出發，以預防為主，有機地運用林業、生物、化學等綜合防治措施，達到有效地控制病害的目的。

3.1 有效的預防措施

在有條件的地方增施一些磷（P）、鉀（K）肥，控制氮（N）肥，提高林木抗病力，在田間管理上，應注意及時清除帶病落葉，減少病菌的侵染來源。另外，由于夏孢子大多降落在離其發生處300米的范圍內，青楊育苗區應選擇遠離發病區300米以外的安全地帶，防止大面積青楊林的病菌孢子擴散傳播到苗圃，減少苗木發病。

3.2 化學防治措施

防治楊樹銹病應在早春用藥，避免傳播。早春時及時發現顏色鮮艷并存在畸形生長的芽，摘除病芽，并及時銷毀，對防止夏孢子擴散侵染效果十分顯著，可大大降低銹病發病率。也可以在早春階段，采取摘除病芽和藥劑防治相結合的防治手段，控制病害發生。對已發病的苗圃，可噴灑50%多菌靈800倍液，對已發生銹病的幼樹和大樹，在發病初期，可噴灑50%代森銨水劑100倍液、退菌特500～1000倍液、25%三唑酮可濕性粉劑1000倍液，或噴灑0.3～0.4度石硫合劑，有一定的效果。發生嚴重時，應在第一次用藥后15～20天噴第二次，連噴2～3次。

3.3 選育抗性品種

目前也發現了一些與楊樹抗病性相關的基因或分子標記，而采用分子標記定位抗性基因和構建抗病基因連鎖遺傳圖譜技術，結合傳統抗病選種育種方法，正成為楊樹抗病育種先進模式。

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