反相高效液相色譜法檢驗(yàn)飲料中人工合成色素

張琦惠 梁偉 劉庚

目的：對(duì)飲料中7種人工合成色素（檸檬黃、新紅、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍(lán)、赤蘚紅）進(jìn)行高效液相色譜法（HPLC）分析。方法 用聚酰胺吸附法或液-液分配法提取，將樣品制成水溶液，經(jīng)Mono Tower C18（3μm×100mm）色譜柱分離后，以甲醇：乙醇銨溶液（0.02mol/L）進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.00ml/min，在檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm條件下進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)保留時(shí)間定性和與峰面積比較進(jìn)行定量。結(jié)果：7種人工合成色素在1.00-20.00mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較為良好（r>0.999），回收率為95%- 101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）0.1%- 0.4%。結(jié)論：高效液相色譜法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可廣泛應(yīng)用于飲料人工合成色素的檢測(cè)。

食品著色劑分為兩類：人工合成色素和天然色素，兩者相比，因人工合成色素的著色效果更佳，且成本較低，而被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。人工合成色素的主要原料包括有苯、甲苯、萘和苯胺等，經(jīng)有機(jī)反應(yīng)（磺化、硝化、鹵化和偶氮化等）后制成色素，長(zhǎng)期食用后會(huì)對(duì)人體健康造成嚴(yán)重的損害。GB 2760- 2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)食品添加劑的使用原則、允許使用的品種、使用范圍和最大使用量或殘留量進(jìn)行了規(guī)定。目前，我國(guó)允許使用的人工合成色素包括有檸檬黃、新紅、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍(lán)、赤蘚紅和酸性紅等。

目前，人工合成色素的檢測(cè)方式主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、超高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等。此次研究根據(jù)GB5009.35- 2016《食品中合成色劑的測(cè)定》中的實(shí)驗(yàn)原理，利用高效液相色譜法對(duì)飲料中的人工合成色素（檸檬黃、新紅、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍(lán)、赤蘚紅）進(jìn)行檢測(cè)，為相關(guān)檢測(cè)單位提供一定的參考依據(jù)。

材料和方法

儀器。Agilent 1260 高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器。

試劑。試劑與標(biāo)準(zhǔn)溶液：檸檬酸溶液（檸檬酸20g，加水至100ml，充分溶解）、甲醇-甲酸（6：4）溶液（甲醇60ml、甲酸40ml，）、無(wú)水乙醇-氨水-水（7：2：1）（無(wú)水乙醇70ml、氨水溶液20ml、水10ml）、乙酸銨溶液（乙酸銨1.54g，加水至1000ml）、PH=4與PH=6的水（水加檸檬酸溶液）。

人工合成色素標(biāo)準(zhǔn)溶液：檸檬黃1.00ml（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心1.00mg/ml）、新紅1.00ml（北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限公司1.00mg/ml）、日落黃2.00ml（中國(guó)計(jì)量學(xué)研究院度0.50mg/ml）、莧菜紅1.00ml（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心1.00mg/ml）、胭脂紅2.00ml（中國(guó)計(jì)量學(xué)研究院0.50mg/ml）、亮藍(lán)2.00ml（中國(guó)計(jì)量學(xué)研究院0.50mg/ml）、赤蘚紅2.00ml（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心0.50mg/ml）。

樣品處理。稱取20g樣品，置于100ml燒杯中，碳酸飲料直接進(jìn)行10分鐘的超聲脫氣與在60℃水浴上脫氣之后進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)果沒(méi)有太大出入，加入檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值分別到2，4，6，然后加熱至60℃，將1g聚酰胺粉加少量水調(diào)成粥狀，倒入試樣溶液中，攪拌片刻，用G3垂融漏斗抽濾，經(jīng)60℃PH=4的水洗滌5次后，用甲醇-甲酸混合溶液洗滌5次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液洗滌5次（每次5ml），收集解析液，加乙酸中和，蒸發(fā)至近干，加水溶解定容至10ml，經(jīng)濾膜0.45 mμ過(guò)濾后，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在此次實(shí)驗(yàn)中pH值在2或4或6時(shí)，所測(cè)的結(jié)果變化不大，故在此次實(shí)驗(yàn)用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH時(shí)，對(duì)分析的結(jié)果影響不大。

液相色譜分析條件。色譜柱：Mono Tower C18（3μm×100mm）代替Agilent5（T）C18 4.6*250mm 5μm發(fā)現(xiàn)粒徑的減少在檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm、柱溫：35℃、流速1.00ml/min、進(jìn)樣量5 lμ、檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；時(shí)對(duì)于合成色素有了更好的分離效果及分析時(shí)間大范圍的縮短；流動(dòng)相：甲醇：乙酸銨溶液（0.02mol/ l）；梯度如表1所示。

結(jié)果

方法的線性范圍和檢出限。將以上7種人工合成色素標(biāo)準(zhǔn)溶液在設(shè)定的色譜條件下檢測(cè)，結(jié)果顯示，在1.00- 20.0mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)7種人工合成色素具有良好的線性關(guān)系，各色素的出峰時(shí)間、平均峰面積、檢出限和RSD如表2所示。

回收率實(shí)驗(yàn)。同時(shí)取18份不含人工合成色素的樣品，各10g，分成2組，分別添加一定量的檸檬黃、新紅、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍(lán)和赤蘚紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)按1.5/1.6進(jìn)行。結(jié)果顯示人工合成色素的回收率為95% - 101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為0.1%- 0.3%。

討論

此次試驗(yàn)基于GB5009.35- 2016《食品中合成著色劑的測(cè)定》開(kāi)展試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用甲醇和0.02mol/L乙酸銨為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，以達(dá)到人工合成色素分離的效果。同時(shí)，將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為254nm、采用色譜柱 Mono Tower C18（3μm×100mm）時(shí)與其他檢測(cè)方法相比，HPLC具備操作簡(jiǎn)便、成本較低和回收率較高等優(yōu)點(diǎn)，適用于飲料中人工合成色素的檢測(cè)。同時(shí)如有陽(yáng)性樣品在無(wú)質(zhì)譜的情況下進(jìn)行光譜200nm- 800nm掃描，與對(duì)照光譜圖進(jìn)行比較、確定。