PCR技術(shù)在食源性致病微生物檢測中的應(yīng)用

余慧

迄今為止，食源性致病微生物引起的中毒事件屢屢發(fā)生，也一直是困擾世界各地的食品安全問題之一，這不僅與致病性微生物本身的特性有關(guān)，同時(shí)更與致病性微生物的檢測方法相關(guān)。傳統(tǒng)的致病性微生物檢驗(yàn)步驟是前/增菌培養(yǎng)、分離純化培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定及血清學(xué)鑒定，這個過程手續(xù)繁瑣、需時(shí)較長、不能滿足人們要求。此時(shí)，PCR（Polymerase Chain Reaction）技術(shù)以靈敏度高、特異性強(qiáng)和時(shí)效高等特點(diǎn)凸顯其優(yōu)勢，為各種有針對性致病微生物快速檢測提供了技術(shù)支持。本文將從近年來PCR技術(shù)在食源性致病微生物檢測中的應(yīng)用來展開論述。

國內(nèi)食源性致病微生物檢測技術(shù)現(xiàn)狀

目前，國內(nèi)大部分標(biāo)準(zhǔn)采用的是傳統(tǒng)方法，它是提供高重復(fù)性、國內(nèi)外公認(rèn)的方法，也是用于解決糾紛的標(biāo)準(zhǔn)方法，但其缺點(diǎn)也顯而易見，近年來，商檢行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)率先采用PCR技術(shù)應(yīng)用到食源性致病菌的檢測中來，例如《SN/T1870- 2016出口食品中食源性致病菌檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》采用的是實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)；《GB4789.6- 2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》的國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)中首次明確應(yīng)用到了PCR技術(shù)。這些標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施給外界釋放出一個信號——PCR技術(shù)越來越廣泛的在食源性致病菌中得到應(yīng)用，也是未來食品微生物檢測發(fā)展的主要趨勢。

PCR技術(shù)在食源性致病微微生物檢測中的應(yīng)用

PCR技術(shù)。（1）PCR技術(shù)的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用。PCR技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。PCR經(jīng)過十多年的發(fā)展與應(yīng)用，現(xiàn)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域最常用的PCR技術(shù)之一。PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加，針對性強(qiáng)，配備預(yù)先設(shè)定特定程序的PCR儀，操作簡單，快捷、準(zhǔn)確性高。蔡亦紅等通過設(shè)計(jì)1對特異性引物，優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件，建立了快速、穩(wěn)定的檢測福氏志賀菌的PCR方法，能夠快速的實(shí)現(xiàn)對食品中的志賀菌的診斷和監(jiān)控。

（2）多重PCR技術(shù)的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用。隨著PCR技術(shù)的成熟運(yùn)用，基于PCR技術(shù)的新方法不斷創(chuàng)新并應(yīng)用到食源性致病微生物的檢測中。多重PCR技術(shù)是在同一PCR反應(yīng)體系里加上多對引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理、試劑和操作過程與常規(guī)PCR技術(shù)相同。多重PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多種食源性致病微生物的同步檢測或鑒定，大幅度提高檢出率，比單一PCR技術(shù)更具高效性和經(jīng)濟(jì)性。徐曉可等針對金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因（nuc）、纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因（ClfA）為靶基因，設(shè)計(jì)篩選2對引物，建立并優(yōu)化了檢測食品中金黃色葡萄球菌的多重PCR體系。

（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用。熒光定量PCR是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或具有熒光標(biāo)記的特異性的探針，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。與常規(guī)PCR技術(shù)相比，可以在單一反應(yīng)體系中檢測多個致病性微生物數(shù)量，它具有特異性更強(qiáng)、能有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)。馬凱等利用特異性的引物與探針對食品中沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌3種食源性致病菌進(jìn)行三重?zé)晒舛縋CR檢測，分別能檢測出這三種致病菌在食品中的含量。

（4）RT- PCR技術(shù)的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用。RT- PCR即反轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。張馳采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT- PCR），以細(xì)菌的RNA為檢測靶標(biāo)，利用RNA與細(xì)菌存活狀態(tài)及數(shù)量的相關(guān)性，建立了普通逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測方法和實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測方法， 能有效地將沙門氏菌與其他親緣關(guān)系較近的腸桿菌科細(xì)菌區(qū)分開來。

展望

近年來，人們越來越重視食源性致病微生物的預(yù)防控制和監(jiān)測，建立更高效、靈敏的微生物檢測技術(shù)是保證食品安全的未來發(fā)展需求。目前，PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于食源性致病微生物的鑒定，隨著各項(xiàng)技術(shù)的成熟，更多的研究更傾向于將基礎(chǔ)技術(shù)、跨學(xué)科技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用，取得了事半功倍的效果，例如MPCRDHPLC技術(shù)、PCR- DGGE指紋分析技術(shù)、PCRELISA酶聯(lián)免疫技術(shù)等的綜合應(yīng)用，克服外源DNA污染、假陽性等缺陷，這些技術(shù)有望成為未來食源性致病性微生物檢測的主要手段。