電吸附分子印跡-固相微萃取聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)復(fù)雜樣品痕量孔雀石綠殘留

陶涌 張玉霞 劉宇

孔雀石綠（malachite green，MG），又名堿性綠，是一種帶有金屬光澤的三苯甲烷類工業(yè)染料，常用來預(yù)防和治療魚類外部真菌和寄生蟲感染，曾廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。由于孔雀石綠具有潛在的致癌、致畸、致突變的作用，美國(guó)早在1993年已將孔雀石綠列為優(yōu)先研究的致癌性化學(xué)物質(zhì)，我國(guó)在農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY5071- 2002無公害食品魚藥使用準(zhǔn)則》中也將孔雀石綠列為禁用藥物。然而，由于沒有低廉有效的替代品，孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用屢禁不止。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)孔雀石綠的檢測(cè)多采用高效液相色譜、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法，這些方法檢測(cè)過程繁瑣，對(duì)檢測(cè)儀器和檢測(cè)人員要求較高，且需要對(duì)樣品進(jìn)行排除干擾和分離富集等復(fù)雜的前處理工作，不利于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。孔雀石綠殘留對(duì)自然系統(tǒng)和人類健康的潛在危險(xiǎn)越來越受到人們的重視，對(duì)其進(jìn)行有效跟蹤、監(jiān)測(cè)非常必要。因此，建立簡(jiǎn)便、快速的分析方法對(duì)孔雀石綠殘留具有重要的意義。

本文結(jié)合分子印跡技術(shù)（Molecularly imprinted polymer，MIP）和固相微萃取技術(shù)（Solid- phase Microextraction，SPME）的優(yōu)點(diǎn)，在MIP- SPME中引入電場(chǎng)作為新的作用力，發(fā)展了電吸附-分子印跡固相微萃取（EE- MIP- SPME）樣品前處理聯(lián)用技術(shù)。設(shè)計(jì)聯(lián)用萃取技術(shù)裝置，以自制的孔雀石綠（malachite green，MG）MIP- SPME涂層研究EE- MIP- SPME技術(shù)的萃取條件和萃取性能，建立MIPMG- SPME/HPLC聯(lián)用分析方法，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物、環(huán)境樣品中孔雀石綠殘留的痕量分析。

孔雀石綠（MG，分析純），隱性孔雀石綠（LMG，分析純）購(gòu)于國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。色譜純乙腈和甲醇購(gòu)自美國(guó)Sigam公司。商品化的固相微萃取纖維（100 μm，PDMS涂層）購(gòu)自美國(guó)Supelco公司。

MIPPy- MWCNTs/Pt纖維制備及EE- MIPSPME實(shí)驗(yàn)在恒電位儀上完成。首先將拋光打磨后的Pt絲和不銹鋼絲，插入多壁羧基碳納米管（MWCNTs- COOH）的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）分散液中，Pt絲為正極，不銹鋼絲為負(fù)極，施加35 V電壓，Pt絲在溶液中停留大約5S后拔出。重復(fù)上述操作，以增加碳納米管在Pt絲上的聚合厚度，最終將Pt絲放入紅外干燥箱，干燥得到MWCNTs/Pt纖維。將制備好的纖維作為正極，不銹鋼絲作為負(fù)極，飽和甘汞電極做參比電極，在吡咯-孔雀石綠（PPyMG，0.05 mol/L）混合溶液中進(jìn)行電聚合反應(yīng)。在0.95 V的電壓下，聚合反應(yīng)40min。在碳納米管表面形成以孔雀石綠為模板分子的分子印跡聚吡咯纖維（MIPPy- MWCNTs/Pt）。

將MIPPy- MWCNTs/Pt纖維為工作電極、不銹鋼絲為對(duì)電極、飽和甘汞電極為參比電極。于20mL小瓶中加入15mL不同濃度的MG溶液，在工作電極施加一定電壓，攪拌下萃取。萃取完成后，纖維用400 μL的2%乙酸的甲醇-水溶液（v/v=8：2）解吸，取20 μL解吸液進(jìn)行液相色譜分析。

色譜條件：在室溫條件下進(jìn)行，Zorbax XDB- C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm×5μm），流動(dòng)相為醋酸/醋酸銨（50 mmol /L，pH為4.5）：乙腈=40：60 （V/V），流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)608 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

以自制孔雀石綠MIPPy- MWCNTs/Pt纖維研究了EE- MIP- SPME方法的萃取條件，如聚合物配方、施加電壓、萃取時(shí)間、解吸溶劑和時(shí)間、萃取溶劑、鹽濃度等。在電場(chǎng)作用下，吸附劑與吸附質(zhì)之間的各種作用力得到增強(qiáng)，使得吸附劑的吸附能力增強(qiáng)。通過在SPME纖維上施加電壓改善固定相的吸附特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的增強(qiáng)吸附。因此，施加電壓的大小是影響萃取過程的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)分別比較了在EE- MIP- SPME、MIP- SPME和SPME不同模式下對(duì)不同濃度MG的水溶液的萃取效率。結(jié)果如圖1所示：EE- MIP- SPME、MIP- SPME的萃取量隨著樣品濃度的增加而增加，EE- MIP- SPME對(duì)MG具有更高的萃取能力，特別是在低濃度范圍內(nèi)具有更明顯的促進(jìn)作用。采用萃取時(shí)間為60 min，樣品溶液1μmol/L，考察了施加電壓對(duì)孔雀石綠MIP涂層萃取性能的影響。電壓在0～0.8V時(shí)，隨著電壓的增加，孔雀石綠的萃取量逐漸增大；當(dāng)電壓超過0.8V以后，MG萃取量迅速降低，結(jié)果如圖2所示。

為了驗(yàn)證所制備的孔雀石綠M IPPyMWCNTs/Pt萃取纖維的選擇性吸附效果，實(shí)驗(yàn)選取孔雀石綠的結(jié)構(gòu)類似物結(jié)晶紫（CV）和非結(jié)構(gòu)類似物蘇丹紅II（Sudan II）兩種對(duì)照物，同時(shí)用MIPPy- MWCNTs/Pt與NIPPy- MWCNTs/ Pt（非分子印跡吡咯聚合物）作為固相微萃取纖維，在最優(yōu)萃取條件下，進(jìn)行EE- MIP- SPME萃取實(shí)驗(yàn)。如圖3所示，與 NIP 萃取纖維相比，MIP萃取纖維對(duì)MG及其結(jié)構(gòu)類似物CV具有更高的萃取效率，這表明MIP萃取纖維對(duì)模板分子及其結(jié)構(gòu)類似物具有很好的選擇，而對(duì)非目標(biāo)分子的識(shí)別較低。目標(biāo)物質(zhì)在 MIP 和NIP 萃取纖維上吸附能力的不同，可能是由于他們?cè)诳讖健⑿螤罴芭c分析物間功能基團(tuán)之間的不同造成。

本實(shí)驗(yàn)方法在最優(yōu)萃取條件下，通過EEMIP- SPME聯(lián)用液相色譜（HPLC），對(duì)MG，CV混合水溶液的檢出限和線性范圍進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在不同濃度水平上隨著目標(biāo)物濃度增加，EE- MIPPy- SPME對(duì)兩種物質(zhì)的吸附效率，在1- 500 μg/L范圍內(nèi)，均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r分別0.9996和0.9958，檢出限為：MG 1.55 μg/L，CV 1.47 μg/L。

為了證實(shí)所建立的實(shí)驗(yàn)方法具有潛在應(yīng)用價(jià)值，我們將該方法用于加標(biāo)魚池水和魚肉樣品中孔雀石綠殘留的分析，圖4顯示的分別是自制MIP萃取纖維在SPME和EE- MIP- SPME模式下對(duì)加標(biāo)魚池水樣萃取后得到色譜圖。可以看出：采用MIP纖維SPME萃取，目標(biāo)物峰高要比NIP纖維的高（圖4c，4d）。圖4e是在MIP纖維上施加直流電壓后萃取得到的色譜圖，得到的峰面積進(jìn)一步增大。兩種實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率分別為87.7%- 108.7%和85.7%- 103.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2% - 9.6%和4.6% -8.3%。實(shí)際樣品中目標(biāo)分子的高回收率和低干擾性，表明本實(shí)驗(yàn)建立的EE- MIP- SPME方法具有較高的選擇性，以孔雀石綠為模板，自制的MIPPy- MWCNTs/Pt萃取纖維具有良好的吸附性能。歐盟法律規(guī)定動(dòng)物源食品中孔雀石綠的殘留量不得超過 2 μg/kg，因此本研究建立的方法能夠適用于監(jiān)測(cè)復(fù)雜食品樣基質(zhì)中痕量孔雀石綠殘留的含量。

1： MG；2： CV；a：魚池水樣品直接進(jìn)樣；b：經(jīng)商品化SPME萃取；c：經(jīng)NIP纖維SPME萃取；d：經(jīng)MIP纖維-SPME萃取；e：經(jīng)EE-MIP-SPME萃取的加標(biāo)樣品

項(xiàng)目基金：湖南省食品藥品監(jiān)督管理局食品藥品安全科技項(xiàng)目（湘食藥科R201720）。