老年病房耐亞胺培南鮑曼不動桿菌整合子及分子流行病學研究

柏淑禹 孫靜

鮑曼不動桿菌作為主要的革蘭陰性非發酵菌,分布廣泛,臨床分離率高,可借助攜帶多個耐藥基因的移動元件,如整合子快速獲得多重耐藥[1]。2005～2014 年,鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率由 31.0 % 逐步上升至 66.7 %, 并在部分地區造成醫院內流行[2]。 本研究通過分析老年病房耐亞胺培南鮑曼不動桿菌攜帶整合子的狀況,研究菌株的同源性,為防治老年科耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的感染及流行提供一定的理論及實踐依據。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集本院老年科2014年3月至2017年3月住院病人臨床分離的耐亞胺培南鮑曼不動桿菌28株。其中痰液21份,尿液、分泌物各3份,胸水1份,無重復分離株。

1.2 主要試劑和儀器 Taq Mix、DNA marker為DBI公司產品;GN13藥敏板卡、哥倫比亞血平板、MH瓊脂平板為梅里埃公司產品;亞胺培南西司他汀鈉為美國默沙東公司產品;聚合酶鏈式反應(PCR)引物由金斯瑞公司合成;GelDoc XR型凝膠成像分析系統為Bio-Rad公司產品。

1.3 細菌鑒定及藥敏實驗 所有菌株均經ATB32GN鑒定條(法國梅里埃公司產品)鑒定。藥敏試驗應用K-B紙片擴散法, 結果按美國臨床實驗室標準協會(NCCLS 2001版)判讀。

1.4 整合子PCR擴增及產物分析 整合子及可變區基因檢測依據文獻設計合成Ⅰ類整合酶基因(Intl Ⅰ)與Intl Ⅱ及可變區基因擴增引物,見表1。細菌DNA提取采用TaKaRa公司試劑盒(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR),于-20 ℃保存。PCR擴增體系20μL:上、下游引物各1μL(10μmol/L),2×Taq DNA Master Mix 10μL,ddH2O 7μL,模板1μL。PCR擴增參數:95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個循環;72 ℃ 7 min。擴增產物經12 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳觀察結果。擴增產物送上海美吉公司測序,測序結果在GenBank網上查詢。

表1 Intl及可變區基因擴增引物

1.5 多位點序列分型(MLST) 試驗菌株進行了MLST 分型,MLST引物操作及MLST序列型(STs)分析見 www.pasteur.fr/mlst 網站。MLST分型使用7 個基因(表2)。PCR擴增體系見前述。反應條件: 94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃45 s,30個循環,72 ℃ 7 min。產物送上海生工公司進行測序,測序結果在上述網頁進行比對,并得出菌株的ST分型。

表2 鮑曼不動桿菌MLST分型引物序列

2 結果

2.1 Ⅰ類整合子耐藥基因盒擴增結果 28株耐亞胺培南鮑曼不動桿菌中,10株(35.7%)攜帶Intl Ⅰ,所有菌株均未擴增出Ⅱ類和Ⅲ類Intl 。對Intl Ⅰ陽性菌株進一步檢測Ⅰ類整合子基因盒類型,10株皆擴增出可變區耐藥基因盒,DNA測序分析整合子可變區攜帶2種基因盒,6株為aacC1-orfx′-aadA1(2542 bp),4株為aacA4-catB8-aadA1(2378 bp)。擴增電泳見圖1。

M:DNA標志物; 1～2:intl;3: aacC1-orfx′-aadA1(2542bp); 4: aacA4-catB8-aadA1(2378bp)圖1 PCR產物電泳圖譜

2.2 MLST分子分型結果 28株鮑曼不動桿菌被分為4個ST 型。ST1145 型14 株(50.0%),ST1417 型 5株(17.9%),ST195 型 4 株(14.3%),ST540 型 3 株(10.7%),未分型2株(7.1%)。其中ST1415型占總菌株數的一半,是老年病科的主要流行類別,廣泛分布于老年科4個病區。

3 討論

老年病房是院內感染的高發地。老年病人基礎疾病復雜,長期住院,免疫力低下,加之鮑曼不動桿菌的生物學特征,使其成為多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的高發人群。鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥,通常對其他抗菌藥物也表現為高耐藥,已是共識。鮑曼不動桿菌的耐藥機制復雜,如滅活酶的產生、孔蛋白的缺失、藥物主動外排泵的過度表達、青霉素結合蛋白的改變等。耐藥基因通過一些可移動的基因元件，如整合子、質粒等,在菌株之間水平轉移,導致細菌耐藥的迅速出現及傳播。

本研究顯示,我院老年病房耐亞胺培南鮑曼不動桿菌攜帶Ⅰ類整合子的陽性率為34.5 %, 低于國內相關報道[3],考慮與細菌基因型別及地區藥物選擇性差異有關。對10株Intl Ⅰ陽性株進一步檢測可變區,6株擴增出2542 bp、4株擴增出2378 bp的可變區耐藥基因盒,分別為aacC1-orfx′-aadA1及 aacA4-catB8-aadA1。aacC1導致慶大霉素耐藥,aadA1導致鏈霉素和壯觀霉素耐藥,aacA4導致阿米卡星、奈替米星和妥布霉素耐藥, catB導致氯霉素耐藥,Ⅰ類整合子參與了分離菌株的耐藥及多重耐藥。不同地區耐藥基因盒種類有所差異,Chen等[4]對華東地區多重耐藥鮑曼不動桿菌的研究顯示,aacA4+catB8+aadA1和dfrXII+orfF+aadA2比率分別為84.3%、15.6%。我院老年病房耐亞胺培南鮑曼不動桿菌對其他種類抗生素的耐藥情況,整合子的作用還有待進一步研究。

不同國家與地區,碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動桿菌流行序列有所差異。近年來,ST2 序列型成為歐洲地區、我國云南某地區的主要流行株。本研究中,MLST結果顯示,28株鮑曼不動桿菌菌株中,ST1145型14株,是我院老年病房耐亞胺培南鮑曼不動桿菌的主要流行型別,其次為ST1417型5株、ST195、ST540基因型各3株。考慮老年病房存在耐亞胺培南鮑曼不動桿菌的感染傳播,提示我們必須加強感染隔離及控制,并對病房環境、物體表面嚴格消毒,以防止醫院感染暴發流行。

本研究提示,我院老年病房存在產碳青霉烯酶鮑曼不動桿菌的流行,進一步開展詳細的流行病學調查、采取必要的防控措施及合理應用抗生素是當務之急。