丹參酮ⅡA對N-甲基-D-天冬氨酸誘導的視網膜神經節細胞損傷的保護作用

蘇志彩 邵蔚 張芳玲

視網膜組織的損傷性疾病如糖尿病視網膜病變、視網膜變性、視網膜中央動脈阻塞在臨床上較為常見。視網膜損傷后,視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells,RGCs)障礙,甚至凋亡,視覺信息的整合和傳遞就會受到損害,從而導致視力受損[1]。尋找適當的藥物阻斷、逆轉甚至預防視網膜細胞的凋亡既是治療疾病的關鍵,又是目前臨床急需解決的問題之一。

由于中藥具有靶點多、不良反應小、協同效果好等優點,學者們對于其在視網膜神經保護作用方面的研究一直方興未艾。丹參酮ⅡA為中草藥丹參的主要有效成分之一,具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等活性,另外還具有保護神經細胞和心血管等方面的作用。Qian等[2]研究發現丹參酮ⅡA 可以上調損傷的體外培養的神經元內 Bcl-xL,進而抑制神經元凋亡。谷氨酸(Glu)是一種興奮性氨基酸,視網膜損傷過程中,RGCs的凋亡和Glu的釋放有關,因此抑制Glu活性,尤其是對N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)型受體的調節,已經是視神經保護的重要措施。有研究表明丹參酮ⅡA預處理可促進星型膠質細胞活化增生,減輕NMDA誘導的腦損傷[3]。因此本實驗采用NMDA誘導小鼠視網膜神經節細胞系RGC-5細胞凋亡,觀察丹參酮ⅡA對RGCs的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 RGC-5細胞(ATCC公司)、丹參酮ⅡA (上海源葉生物有限公司)、引物(上海生工生物技術工程有限公司)。NMDA、四甲基偶氮唑藍(MTT)、地卓西平 (MK-801, NMDA受體拮抗劑)、hoechst 33258染料均購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:將RGC-5細胞放置于含10%的胎牛血清DMEM培養液中,在5%CO2,37 ℃的培養箱中培養,用0.25%的胰蛋白酶每2～3 d消化傳代1次。

1.2.2 MTT比色法測定細胞存活率:在96孔培養板內種植RGC-5細胞(1×105/mL),貼壁后將細胞分為4組:NMDA損傷組、正常對照組、MK-801陽性對照組、丹參酮ⅡA預保護組,每組設6個復孔。丹參酮ⅡA預保護組又分為3個亞組,分別加入0.4μg/mL、4μg/mL、40μg/mL的丹參酮ⅡA;MK-801陽性對照組加入MK-801使其終濃度為10μmol/L;NMDA損傷組和正常對照組加入等體積的DMEM完全培養基。將培養板放置于5%CO2,37 ℃的細胞培養箱內培養12 h,然后取出細胞棄去培養基,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍。除正常對照組以外,其余各組均加入甘氨酸10μmol/L和NMDA 100μmol/L作用30 min,PBS沖洗3遍后恢復到原來的培養液環境。36 h后每孔加入20μL新鮮配置的MTT(5 mg/mL),在波長490 nm處用酶標儀測定吸光度(OD值),計算細胞存活率。

1.2.3 Hoechst 染色:按上述方法將培養在蓋玻片上的細胞分組和處理后(依據上述MTT結果,丹參酮ⅡA預保護組選用4μg/mL 的藥物濃度),用多聚甲醛(4%)固定,PBS沖洗3次,然后加入 hoechst 33258工作液染色5 min,漂洗3遍后封片,用熒光顯微鏡觀察結果。熒光顯微鏡下,活細胞被染成均質的藍色熒光,呈橢圓形,而凋亡的細胞核呈濃染亮藍色顆粒塊狀,核固縮。隨機選取6個視野計算凋亡百分率(凋亡百分數=凋亡細胞核數/細胞核總數)。

1.2.4 半定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測Bcl-2、Bax的mRNA表達:提取4組細胞總RNA(采用Trizol一步法),逆轉錄反應得到cDNA,以cDNA為模板(2μL),按照半定量RT-PCR試劑盒提供的步驟進行擴增。Bcl-2上游引物5′-CTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′,下游引物5′-CCCAGCCTCCGTTATCCT-3′;內參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′,下游引物5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′;Bax上游引物5′-GCAAACTGGTGCTCAAGGC-3′,下游引物5′-GGGGTCCCGAAGTAGGAGA-3′。擴增的Bcl-2、Bax目的片段長度均為161 bp,內參GADPH長度為520 bp。采用含溴化乙錠的1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物,Kodak凝膠電泳圖像系統進行掃描分析。

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA對RGC-5細胞活性的影響 與NMDA損傷組相比,MK-801對照組與丹參酮ⅡA預保護組中的4μg/mL和40μg/mL亞組細胞生存率顯著提高(P<0.05),0.4μg/mL丹參酮ⅡA預保護亞組的細胞生存率差異無統計學意義(P>0.05)。其中4μg/mL和40μg/mL亞組間的細胞生存率差異無統計學意義(P>0.05),因此,選擇4μg/mL的藥物濃度為后續的有效藥物濃度。見圖1。

注:與NMDA損傷組比較,*P<0.05圖1 各組RGC-5細胞存活率

2.2 丹參酮ⅡA對RGC-5細胞形態的影響 正常對照組RGC-5細胞呈單層生長,貼壁性好,透光性好,細胞核較大,有較短的突起,隨著細胞的生長,突起可以互相連接;NMDA損傷組RGC-5細胞則皺縮、變圓,透亮度消失,甚至僅剩細胞碎片;MK-801陽性對照組及丹參酮ⅡA預保護組RGC-5細胞仍保持正常細胞輪廓,皺縮變形,但程度較輕。見圖2。

注:a:正常對照組;b:NMDA損傷組;c:MK-801陽性對照組;d:丹參酮ⅡA預保護組圖2 各組RGC-5細胞的形態(倒置相差顯微鏡×20)

2.3 丹參酮ⅡA對RGC-5細胞凋亡的影響 Hoechst染色檢測凋亡細胞,NMDA損傷組的凋亡細胞百分率為(37.4±0.56)%,而正常對照組為(3.25±1.12)%,差異有統計學意義(P<0.05);丹參酮ⅡA預保護組和MK-801陽性對照組細胞凋亡百分率分別為(5.9±1.05)%和(6.7±1.43)%,差異無統計學意義(P>0.05),但均明顯低于NMDA損傷組(P<0.05)。見圖3。

注:A:正常對照組;B:NMDA損傷組;C:MK-801陽性對照組;D:丹參酮ⅡA預保護組圖3 各組Hoechst 染色結果

2.4 丹參酮ⅡA對RGC-5細胞內Bcl-2、Bax 的mRNA水平影響 與正常對照組相比,NMDA損傷組Bcl-2的mRNA表達降低(0.27±0.08),Bax的mRNA表達增加(5.23±0.16),差異有統計學意義(P<0.05);與NMDA損傷組比較,丹參酮ⅡA預保護組Bcl-2的mRNA表達增加(0.84±0.16),Bax的mRNA表達下降(1.57±0.10),差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

RGCs的凋亡是視網膜退行性眼病的共同病理特點,可導致視功能不可逆性損害,直至失明。目前普遍認為Glu受體遍布視網膜各層,糖尿病視網膜病變等疾病使細胞外 Glu大量聚集,造成靶細胞損害,并且主要影響RGCs[4]。眾多證據表明,Glu大量聚集后激活RGCs細胞膜上大量的NMDA受體,引起細胞外Ca2+內流及細胞內鈣庫的Ca2+動員,導致細胞內Ca2+超載,過量的Ca2+激活細胞內依賴Ca2+的信號級聯途徑,最終導致神經細胞凋亡[5]。

RGC-5屬于未分化的幼稚細胞,除不具有電生理學特性外,其他生物學行為和原代培養RGCs基本相似,因此近年來在實驗研究中廣泛應用。該模型克服了RGCs原代培養難分離、培養條件要求高、不能傳代等弊端。Glu作為一種主要的興奮性神經遞質在視網膜上發揮重要作用,NMDA受體是Glu受體的一種亞型,在病理狀態下,NMDA受體被激活,從而引起RGCs的凋亡,本實驗在體外模擬RGCs損傷后的微環境,即在體外培養的RGC-5中加入NMDA,成功誘導了RGCs凋亡。

注:A:Bcl-2 mRNA;B:Bax mRNA;Tan ⅡA:丹參酮ⅡA圖4 各組Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

丹參酮ⅡA是近年來國內外研究開發的熱點之一。大量研究表明,丹參酮ⅡA有多種生物學活性,對腦神經具有保護作用,如抗氧化、防止神經細胞凋亡、維持腦內離子穩態、保護血腦屏障等,是潛在的神經保護中藥單體。有學者發現丹參酮ⅡA 預處理可促進缺血后星型膠質細胞活化增生,減輕缺血性腦損傷[6]。也有學者發現丹參酮預處理可以通過減少神經節細胞的凋亡對視網膜缺血再灌注損傷起保護作用,其作用機制可能是通過調節Bcl-2的表達來實現[7]。本研究結果顯示,與NMDA損傷組相比,丹參酮ⅡA預保護組的RGC-5細胞損傷明顯減輕,當丹參酮ⅡA達4μg/mL的濃度時,RGC-5存活率可有效提高,但濃度增高至40μg/mL時,神經元保護作用反而并沒有增加,此結果與劉美琳等[8]的研究結果基本一致,說明丹參酮ⅡA的保護作用僅在一定范圍內呈濃度依賴性。我們又進一步將丹參酮ⅡA預保護組和MK-108陽性對照組進行比較,發現兩者差異無統計學意義,從而進一步證實了丹參酮ⅡA的視網膜神經保護作用。韓若東等[9]研究發現,丹參酮ⅡA對大鼠早期腦缺血和腦缺血再灌注損傷具有保護作用,其作用機制可能是上調Bcl-2表達、下調Bax表達。本實驗也顯示丹參酮ⅡA預保護后能逆轉NMDA處理后引起的Bcl-2 mRNA的表達下降,Bax的mRNA表達上調,從而起到神經保護作用。

本實驗利用NMDA誘導建立RGCs損傷模型,并證實丹參酮ⅡA通過調節Bax、Bcl-2的表達抑制NMDA誘導的細胞凋亡,為進一步的體內研究和臨床應用提供理論依據。