不同時期花生莖葉中芳樟醇含量的測定

歐可可，張平平，2，*，麗蕊，趙曉彤，王洪杰

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

花生莖葉為豆科落花生屬（Arachis）植物落花生（A.hypogaea）的地上部分[1]，我國是花生生產(chǎn)大國，每年產(chǎn)生花生莖葉約有200萬噸（干重）[2]，但花生莖葉主要作為動物飼料以及燃料使用，甚至很大一部分被直接丟棄，造成了極大的浪費。研究表明，從花生莖葉中分離得到的化合物主要有有機(jī)酸類、油脂類、脂肪烷烴類、多酚類以及芳樟醇類物質(zhì)[3]，具有鎮(zhèn)靜催眠[4-8]、降壓[9]、抗氧化[10-11]等作用。早在明洪武年間，我國民間就有花生莖葉入藥的記載，近代編纂的《中藥大辭典》中明確記載花生莖葉具有治療抑郁、焦慮和失眠的功效，以及《中華本草》中提到花生葉水提液250 g/kg灌胃不引起小鼠死亡。鄧?yán)诘萚12-13]研究發(fā)現(xiàn)花生莖葉中芳樟醇是改善睡眠的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，能夠顯著干預(yù)小鼠大腦中與睡眠相關(guān)的4條信號通路，從而實現(xiàn)對睡眠的積極調(diào)控。民間不少地方的人們也常將花生葉水煮后飲用，以緩解失眠多夢。

近年來，花生莖葉助眠的研究主要集中在對花生莖葉揮發(fā)性油成分的鑒定及花生莖葉經(jīng)水提和有機(jī)溶劑提取后，在動物助眠實驗方面的簡單對比，針對助眠成分提取的工藝優(yōu)化及提取物中的助眠成分分析涉及較少。因此本研究以助眠成分之一芳樟醇為檢測指標(biāo)，采用莖葉分離的方式，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對花生葉中助眠成分芳樟醇的提取及測定條件進(jìn)行優(yōu)化，從而提高花生葉中芳樟醇的溶出率，并分析比較初花期和成熟期花生莖、葉中芳樟醇的含量差異及變化，以期為花生莖葉相關(guān)助眠產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)和參考，促進(jìn)花生莖葉資源的綜合、高效利用，為失眠癥患者日常非醫(yī)改善睡眠提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

初花期、成熟期花生莖葉：自采于山東省濟(jì)寧市泗水縣張莊鎮(zhèn)；芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，艾勒科技有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市北辰方正試劑廠；乙腈（色譜純）：天津市圣信唯科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

400A多功能粉碎機(jī)：永康市紅太陽機(jī)電有限公司；DHG-9625A熱風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CA-1115旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；LGJ-18S真空冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；Milli-Q純水儀：天津奧佳科技股份有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀（配紫外檢測器）：安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法與步驟

1.3.1 芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg，置于5 mL棕色容量瓶中，加入無水乙醇使其溶解，并定容至刻度，搖勻，制得4 mg/mL的芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，再準(zhǔn)確吸取4 mg/mL芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)溶液250 μL至10 mL的容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，搖勻，得0.1 mg/mL的芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為母液，4℃下避光存放備用。

1.3.2 樣品制備

將收獲的初花期和成熟期的花生莖葉，清洗后熱風(fēng)干燥至水分含量至5%，分別將莖葉分離、粉碎，過40目～60目篩，分別經(jīng)料液比 1∶100（g/mL），90℃熱水浸提2次，每次20 min，紗布過濾，合并2次濾液，將濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮15倍后，4 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80℃冰箱冷凍過夜，再經(jīng)真空冷凍干燥得花生莖、葉凍干粉。

分別精密稱取1.00 g初花期、成熟期花生莖、葉凍干粉末，置具塞比色管中，向花生葉凍干粉中分別加入無水乙醇8 mL，花生莖凍干粉中分別加入無水乙醇5 mL，搖勻，取上清液，過0.2 μm濾器，即得。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Venusil XBP C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為以乙腈∶水=1∶1（體積比）；流速1.0 mL/min，紫外檢測波長為205 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.4 方法學(xué)考察

分別從0.1 mg/mL芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品母液中準(zhǔn)確吸取20、40、60、80、100 μL 至 10 mL 棕色容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，制成梯度濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.3的色譜條件進(jìn)樣測定，以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別取同一芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液、同一樣品溶液、1.3.2條件下平行制備的6份樣品溶液及加標(biāo)樣品溶液（精密稱取6份已知芳樟醇含量的花生葉凍干粉0.50 g，分別準(zhǔn)確加入0.1 mg/mL芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL）在1.3.3的最優(yōu)色譜條件進(jìn)行分析檢測，根據(jù)芳樟醇色譜峰的峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），以此分析精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及樣品加標(biāo)回收率。

1.3.5 花生葉中芳樟醇提取條件的優(yōu)化

1.3.5.1 單因素試驗

將干燥后的花生葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，分別過20～40、40～60、60～80、80～100 目篩后，稱取適量花生葉干粉，以水作為提取溶劑，在料液比分別為 1 ∶50、1 ∶70、1 ∶100、1 ∶125、1 ∶150（g/mL），提取溫度分別為 80、85、90、95、100 ℃，提取時間分別為 5、10、20、30、40 min 的提取條件下，提取2次進(jìn)行單因素試驗，再將濾液分別合并、濃縮、凍干、復(fù)溶后，經(jīng)高效液相色譜測定芳樟醇含量，分別考察不同提取條件對花生葉中芳樟醇含量的影響。

1.3.5.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計L9（34）正交試驗優(yōu)化提取條件，分別考察粉碎度、料液比、提取溫度、提取時間對花生葉中芳樟醇含量的影響，以確定最佳提取條件，正交試驗因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Test factors of orthogonal experiment levels table

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)曲線及定性分析

以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為Y=42.85X+0.25，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，表明在0.2 μg～1.0 μg范圍內(nèi)，芳樟醇峰面積值與進(jìn)樣量的線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的色譜圖見圖2、圖3，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品都在7.2 min出峰且芳樟醇峰和樣品中的其他組分均能達(dá)到基線分離。

圖1 線性關(guān)系考察Fig.1 Investigation of linear relation

圖2 芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of linalool standard

圖3 樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of sample

2.1.2 精密度分析

取同一芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在1.3.3的色譜條件下，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見表2。

表2 精密度測定結(jié)果Table 2 Results of precision analysis

芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的RSD為1.33%（n=6），表明該方法有良好的精密度。

2.1.3 穩(wěn)定性分析

取同一樣品溶液，在1.3.3的色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣測定，結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性測定結(jié)果Table 3 Results of stability analysis

供試品溶液中芳樟醇峰面積的RSD為1.41%（n=6），表明該試驗中芳樟醇在放置10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復(fù)性分析

取1.3.2條件下平行制備的同一樣品溶液6份，按1.3.3的色譜條件進(jìn)行分析檢測，結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性測定結(jié)果Table 4 Results of repeatability analysis

供試品溶液中芳樟醇峰面積的RSD為1.30%（n=6），表明該方法重現(xiàn)性優(yōu)良。

2.1.5 樣品加標(biāo)回收率分析

取加標(biāo)樣品溶液，按1.3.3的色譜條件進(jìn)行分析檢測，結(jié)果見表5。

表5 回收率測定結(jié)果Table 5 Results of recovery analysis

平均加樣回收率為100.25%，RSD=1.40%，表明該方法的加樣回收良好，結(jié)果可靠，可以用于花生莖葉中芳樟醇含量的測定。

2.2 花生葉中芳樟醇提取條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗

粉碎度和料液比對花生葉芳樟醇含量的影響見圖4、圖5。

圖4 粉碎度對花生葉芳樟醇含量的影響Fig.4 Effects of comminution on linalool contents in peanut stems and leaves

由圖4可知，當(dāng)粉碎度為60目～80目時，芳樟醇含量達(dá)到最高；當(dāng)粉碎度在80目以上時，芳樟醇含量明顯下降，可能是由于較細(xì)的顆粒會因其表面積過大，產(chǎn)生吸附作用，導(dǎo)致其擴(kuò)散速度下降，溶出率下降[14]。由圖5可知，隨溶劑用量的增加，芳樟醇含量逐漸增大，當(dāng)料液比為 1∶100（g/mL）時，含量達(dá)到最大值；繼續(xù)增加溶劑用量，芳樟醇含量趨于平穩(wěn)，可能由于在一定料液比的條件下，芳樟醇的溶出量達(dá)到了飽和，之后則含量基本不再變化[15]。因此，綜合考慮選擇粉碎度為 60目～80目、料液比為 1∶100（g/mL）。

圖5 料液比對花生葉芳樟醇含量的影響Fig.5 Effects of solid-liquid ratio on linalool contents in peanut stems and leaves

提取溫度和提取時間對花生葉芳樟醇含量的影響見圖6、圖7。

圖6 提取溫度對花生葉芳樟醇含量的影響Fig.6 Effects of extraction temperature on linalool contents in peanut stems and leaves

圖7 提取時間對花生葉芳樟醇含量的影響Fig.7 Effects of extraction time on linalool contents in peanut stems and leaves

由圖6可知，在80℃～90℃時，隨溫度升高，芳樟醇含量快速增加，繼續(xù)升高溫度，芳樟醇含量基本不變，可能與芳樟醇易揮發(fā)的性質(zhì)有關(guān)，過高的溫度迅速增加了芳樟醇揮發(fā)，最終使得溶出與揮發(fā)達(dá)到動態(tài)平衡。由圖7可知，在10 min內(nèi)時，芳樟醇含量隨時間的延長增加較緩慢，10 min～20 min，芳樟醇含量迅速增加，20 min以后則芳樟醇含量增加特別緩慢，可能是隨時間延長，水溫降低，使得溶出速度大大降低。因此，綜合考慮選擇溫度為90℃、提取時間為20 min。

2.2.2 正交試驗

正交試驗結(jié)果及方差分析見表6和表7。

表6 正交試驗結(jié)果Table 6 The results of orthogonal experiments

表7 正交試驗方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal test

由表6可知，最優(yōu)提取條件為A1B2C2D2，即粉碎度40目～60目、料液比 1∶100（g/mL）、提取溫度90℃、提取時間20 min。在此條件下驗證試驗測得花生葉中芳樟醇含量為2.32 mg/kg。由表7可知，料液比和提取溫度對花生葉中芳樟醇的提取有顯著影響，而提取時間和粉碎度對其提取的影響差異不顯著。各提取因素對花生葉中芳樟醇含量提取的影響主次順序為：料液比＞提取溫度＞提取時間＞粉碎度。

2.3 不同時期花生莖、葉中芳樟醇含量的測定

分別取1.3.2條件下制備的初花期、成熟期的花生莖、葉，按1.3.3的色譜條件進(jìn)行分析檢測，平行測定3次，依據(jù)測得的峰面積計算芳樟醇的含量，并對其進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見表8。

表8 不同時期花生莖、葉中芳樟醇含量Table 8 Linalool contents in peanut stems and leaves at differentperiods

由表8可知，不同時期花生葉中芳樟醇含量均高于花生莖，其中初花期花生葉中芳樟醇含量是莖的4.0倍，成熟期花生葉中芳樟醇含量是莖的3.5倍，且初花期和成熟期花生葉中芳樟醇含量無明顯差異。

3 結(jié)論

建立一種測定花生莖葉中芳樟醇含量的高效液相色譜法：色譜柱為Venusil XBP C18，流動相為乙腈∶水=1 ∶1，流速 1.0 mL/min，檢測波長 205 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10 μL。并在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗確定花生葉中芳樟醇的最佳提取條件：粉碎度40目～60目，料液比1∶100（g/mL），提取溫度90℃，提取時間20 min。結(jié)果表明：所建立的花生莖葉中芳樟醇的高效液相色譜分析方法具有較好的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性，平均回收率為100.25%，RSD為1.40%，可作為花生莖葉中芳樟醇的含量的測定。此高效液相色譜法對優(yōu)化條件下得到的不同時期花生莖、葉中的芳樟醇含量進(jìn)行測定，不同時期花生葉中芳樟醇含量均高于莖，其中初花期花生葉中芳樟醇含量是莖的4.0倍，成熟期花生葉中芳樟醇含量是莖的3.5倍，并且初花期和成熟期花生葉中芳樟醇含量無明顯差異。