表面活性劑對(duì)出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋(píng)果酸的影響

趙廷彬，陳暢，殷海松，孫愛(ài)友，喬長(zhǎng)晟，4，*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津300350；3.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237；4.天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津300457）

聚蘋(píng)果酸（polymalic acid，PMLA）是一種水溶性脂肪族聚酯[1-2]，是蘋(píng)果酸的聚合物。蘋(píng)果酸是一種C4二羧酸，分子中含有羥基和羧基，通過(guò)分子結(jié)構(gòu)中羧基和羥基間的酯化作用聚合形成PMLA，因此PMLA分子結(jié)構(gòu)中含有大量的酯鍵、羥基和游離羧基[3-4]。PMLA具有高度的水溶性、吸水性、生物相容性、可降解性、可化學(xué)衍生性及無(wú)免疫原性等，這些獨(dú)特的性質(zhì)決定了PMLA在醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境治理、可降解材料、食品包裝等方面有著廣闊的應(yīng)用前景[5-7]。

出芽短梗霉合成的PMLA是一種胞外產(chǎn)物，在釋放過(guò)程中如果阻力增大，PMLA會(huì)在胞內(nèi)大量的積累，造成阻遏效應(yīng)，PMLA的產(chǎn)量會(huì)下降，菌體的效能降低。表面活性劑作為一種同時(shí)含有親油基和親水基的有機(jī)化合物，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到眾多的現(xiàn)代工業(yè)領(lǐng)域中[8-9]。有研究表明，表面活性劑能夠增大細(xì)胞膜的通透性，有利于胞內(nèi)產(chǎn)物的外排和菌體對(duì)周?chē)鸂I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[10-11]。

本文選取4種表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、曲拉通 X-100（Triton X-100）、吐溫 60（Tween 60）、吐溫 80（Tween 80），研究它們對(duì)出芽短梗霉生長(zhǎng)和PMLA合成的影響，并對(duì)最佳影響因子的作用機(jī)理做了初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 菌種

出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）：保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO.3337。

1.1.2 材料

1）斜面培養(yǎng)基：土豆培養(yǎng)基。

2）種子培養(yǎng)基：蔗糖60 g/L，酵母膏3 g/L，丁二酸2 g/L，硫酸銨 1 g/L，K2CO30.4 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.005g/L，玉米漿0.1%（體積分?jǐn)?shù)），碳酸鈣20 g/L（單獨(dú)滅菌）。

3）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 100 g/L，蛋白胨35 g/L，KH2PO40.1 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KCl 0.5g/L，MnSO40.05g/L，碳酸鈣20g/L（單獨(dú)滅菌）。

1.1.3 儀器和設(shè)備

UVmini-1240紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；SKY-2102搖床：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；YJ-875S醫(yī)用超凈臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；SPK-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LD5-10高速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心廠；Agilent 1100高效液相色譜分析儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀：碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 斜面培養(yǎng)

將保存于4℃的斜面上的菌取出用接種針轉(zhuǎn)接到新鮮的斜面上，并置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d～4 d。

1.2.1.2 種子培養(yǎng)

取出培養(yǎng)好的斜面，在無(wú)菌操作條件下，用無(wú)菌生理鹽水將斜面的孢子洗下，制成孢子懸液。然后按照10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量，即取5 mL接種到裝有45 mL種子培養(yǎng)基并滅好菌的500 mL擋板瓶中，用8層紗布封好瓶口，置于溫度25℃恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)40 h。

1.2.1.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子液在無(wú)菌條件下混勻，然后按照10%（體積分?jǐn)?shù)）的接種量，即取5 mL接種到裝有45 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基并滅好菌的500 mL擋板瓶中，用8層紗布封好瓶口，置于溫度25℃恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)6 d。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 菌體量測(cè)定

取10 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min。倒掉上清，在菌體沉淀中滴加3 mol/L的稀鹽酸溶液，中和發(fā)酵液中剩余的碳酸鈣，直到不再有氣泡產(chǎn)生為止，5 000 r/min離心15 min，倒掉上清。用10 mL生理鹽水重懸菌體，5 000 r/min離心15 min，倒掉上清，將離心管置于80℃烘箱中烘干至恒重，稱(chēng)量菌體干重（g/L）。

1.2.2.2 發(fā)酵液中PMLA的測(cè)定[12]

取10 mL發(fā)酵液于15 000 r/min離心10 min除去菌體，用移液管取5 mL上清液于水解反應(yīng)釜中，同時(shí)加入等體積的1 mol/L H2SO4溶液，于90℃條件下水解12 h，將PMLA完全水解為單體蘋(píng)果酸。高效液相色譜法 （high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)水解前后的蘋(píng)果酸的含量，兩者之差即為PMLA的產(chǎn)量。

HPLC的檢測(cè)條件如下，色譜柱：Prevail C18色譜柱（4.6 mm×150 mm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相（體積比）∶25 mmol/L KH2PO4溶液∶乙腈=95∶5（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至 2.5）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.2.2.3 細(xì)胞膜脂肪酸組成的檢測(cè)

取10 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心2 min，棄上清液。向離心管中加入4 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸菌體，8 000 r/min 離心 2 min，棄上清液，重復(fù)上述操作2次，收集菌體。按照參考文獻(xiàn)[13]中的方法進(jìn)行菌體脂肪酸的提取與檢測(cè)。

1.2.2.4 熒光強(qiáng)度測(cè)定[14]

取10 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心2 min，棄上清液，并用PBS緩沖液洗菌2次。用PBS溶液稀釋菌體，使得菌體量控制在106個(gè)/mL～107個(gè)/mL。取0.5 mL菌體稀釋液，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，避光反應(yīng)30 min后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2.5 電鏡檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[15]中的試驗(yàn)方法進(jìn)行出芽短梗霉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS對(duì)出芽短梗霉生長(zhǎng)和PMLA合成的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入濃度為0、0.05、0.1、0.5、1.0 g/L的陰離子型表面活性劑SDS，搖床發(fā)酵6 d，測(cè)定其菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)PMLA的情況，結(jié)果如圖1所示。

從圖1中可以看出，隨著SDS濃度的增加，出芽短梗霉發(fā)酵后的細(xì)胞生物量和PMLA的產(chǎn)量都呈下降趨勢(shì)，并且菌體生物量和PMLA的產(chǎn)量都比空白組低，說(shuō)明SDS對(duì)發(fā)酵過(guò)程抑制作用比較明顯。隨著SDS添加量的增大，菌體生物量和PMLA產(chǎn)量的下降的幅度逐漸變小。當(dāng)SDS添加量達(dá)到0.5 g/L后，菌體生物量和PMLA產(chǎn)量就不再發(fā)生較大的變化。由此得出，較低濃度的SDS對(duì)出芽短梗霉的生長(zhǎng)和PMLA的合成表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制能力。

圖1 添加SDS對(duì)出芽短梗霉生長(zhǎng)和PMLA合成的影響Fig.1 Effect of SDS addition on PMLA production and cell growth by A.pullulans

2.2 曲拉通X-100對(duì)出芽短梗霉生長(zhǎng)和PMLA合成的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為0、5、10、20、40 g/L的曲拉通X-100，搖床培養(yǎng)6 d后，測(cè)定其菌體生物量和PMLA產(chǎn)量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 添加Triton X-100對(duì)出芽短梗霉生長(zhǎng)和PMLA合成的影響Fig.2 Effect of Triton X-100 addition on PMLA production and cell growth by A.pullulans

從圖2中可以看出，加入曲拉通X-100后，生物量和PMLA產(chǎn)量的變化趨勢(shì)是不一致的。當(dāng)曲拉通X-100濃度小于10 g/L時(shí)，PMLA產(chǎn)量隨曲拉通X-100添加量的增加先降低后升高，并當(dāng)曲拉通X-100濃度為5 g/L時(shí)，PMLA的產(chǎn)量最低，是17.21 g/L，其產(chǎn)量較對(duì)照組下降了36.89%。當(dāng)曲拉通X-100濃度高于10 g/L后，隨曲拉通X-100濃度增大PMLA產(chǎn)量逐漸下降。整體來(lái)看，曲拉通X-100對(duì)PMLA的產(chǎn)量沒(méi)有提高作用。但加入曲拉通X-100可以促進(jìn)出芽短梗霉細(xì)胞的生長(zhǎng)，隨著曲拉通X-100濃度的增大，生物量先上升，隨后有所下降，并在曲拉通X-100濃度為5 g/L時(shí)，生物量達(dá)到最大。結(jié)合曲拉通X-100對(duì)生物量和PMLA產(chǎn)量的影響，可以得出，在低濃度曲拉通X-100范圍內(nèi)（小于5 g/L），培養(yǎng)基中的碳源主要用于菌體生長(zhǎng)，由于對(duì)碳源的競(jìng)爭(zhēng)性利用，導(dǎo)致PMLA產(chǎn)量下降。在高濃度范圍內(nèi)（大于5 g/L），雖然菌體量和空白組相接近，但在菌體內(nèi)部PMLA合成酶系可能受到高濃度曲拉通X-100的抑制，導(dǎo)致PMLA的產(chǎn)量低于對(duì)照組。

2.3 吐溫60對(duì)出芽短梗霉生物量和PMLA產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為0、1、2、5、10、15 g/L的吐溫60，搖床培養(yǎng)6 d后，測(cè)定其菌體生物量和PMLA產(chǎn)量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 添加Tween 60對(duì)出芽短梗霉生長(zhǎng)和PMLA合成的影響Fig.3 Effect of Tween 60 addition on PMLA production and cell growth by A.pullulans

從圖3中可以看出，加入吐溫60對(duì)出芽短梗霉菌體生長(zhǎng)和PMLA合成的影響是有區(qū)別的。在較低濃度范圍內(nèi)（吐溫60濃度小于2 g/L），PMLA的產(chǎn)量隨吐溫60添加量的增加而提高，并在吐溫60濃度為2 g/L時(shí)PMLA產(chǎn)量最高，達(dá)到28.87 g/L，較對(duì)照組產(chǎn)量提高了20.86%。而添加吐溫60對(duì)于出芽短梗霉菌體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，并在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)（吐溫60濃度小于5 g/L），菌體量隨著吐溫60添加量的增多而增大。

2.4 吐溫80對(duì)出芽短梗霉生長(zhǎng)和PMLA產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為0、1、2、5、10、15 g/L的吐溫80，搖床培養(yǎng)6 d后，測(cè)定其菌體生物量和PMLA產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 添加Tween 80對(duì)出芽短梗霉生長(zhǎng)和PMLA合成的影響Fig.4 Effect of Tween 80 addition on PMLA production and cell growth by A.pullulans

由圖4可知，隨著吐溫80濃度增加，PMLA的產(chǎn)量較空白對(duì)照組有所提高，并在吐溫80添加量為2 g/L時(shí)PMLA產(chǎn)量最高，達(dá)到31.36 g/L，較空白對(duì)照組提高了30.5%。但當(dāng)吐溫80濃度大于10 g/L時(shí)，PMLA的產(chǎn)量急劇下降，并且低于空白對(duì)照組。菌體生物量隨著吐溫80的添加，濃度有所提高，說(shuō)明吐溫80能促進(jìn)出芽短梗霉菌體的生長(zhǎng)。

由以上試驗(yàn)可得，吐溫60和吐溫80對(duì)出芽短梗霉產(chǎn)PMLA都有促進(jìn)作用，且吐溫80比吐溫60的作用效果好，因此選用吐溫80作為最佳影響因子進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 吐溫80對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞脂肪酸組成的影響

吐溫80的添加對(duì)細(xì)胞脂肪酸組成成分的影響見(jiàn)表1。

表1 吐溫80的添加對(duì)細(xì)胞脂肪酸組成成分的影響Table 1 Fatty acid composition of A.pullulans cells grown with and without Tween 80

出芽短梗霉細(xì)胞含有的脂肪酸主要有棕櫚酸（C16：0），棕櫚油酸（C16：1），硬脂酸（C18：0），油酸（C18：1），亞油酸（C18：2）。在吐溫 80 存在的情況下，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例從2.11上升到了2.85，比重提高了25.96%。脂肪酸不飽和度的提升主要是因?yàn)樽貦八岷康南陆狄约皝営退岷康脑黾印?/p>

脂肪酸不飽和鍵的含量和鏈長(zhǎng)會(huì)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，不飽和鍵含量越高，膜脂的流動(dòng)性和通透性就會(huì)越大。細(xì)胞膜的通透性的增強(qiáng)，更加有利于菌體細(xì)胞從周?chē)h(huán)境中攝入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)使得胞內(nèi)物質(zhì)更加容易的往胞外分泌[15-16]。

2.6 吐溫80對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞膜通透性的影響

利用流式細(xì)胞儀測(cè)定碘化丙啶（PI）染色的細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化，考察了吐溫80對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響。熒光染料PI是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，它是一種溴化乙啶的類(lèi)似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過(guò)活細(xì)胞膜，但卻能穿過(guò)破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色[14]，流式細(xì)胞儀檢測(cè)吐溫80對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響見(jiàn)圖5。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)吐溫80對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響Fig.5 Effect of Tween-80 on cell membrane permeability of A.pullulans assessed by flow cytometry

通過(guò)差速離心法去除碳酸鈣，收集菌體細(xì)胞，加入PI染色液，暗反應(yīng)30 min后進(jìn)行檢測(cè)。從圖5中可以看出，出芽短梗霉在不同發(fā)酵條件下熒光強(qiáng)度是不同的?？瞻捉M熒光強(qiáng)度平均值為8.74，試驗(yàn)組熒光強(qiáng)度平均值為12.19，熒光強(qiáng)度提高了39.47%。試驗(yàn)組熒光強(qiáng)度高于空白對(duì)照組，說(shuō)明加入吐溫80使得菌體細(xì)胞膜的通透性得到了提高。

2.7 吐溫80對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡結(jié)果圖見(jiàn)圖6。

在添加和不添加2 g/L吐溫80的情況下，利用透射電鏡觀察了出芽短梗霉的細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。由圖6可知，在添加吐溫80的情況下細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與不添加時(shí)是有明顯的差異的?？瞻捉M中，細(xì)胞膜是規(guī)則的、清晰的、圓潤(rùn)緊湊的。試驗(yàn)組中，細(xì)胞膜是不規(guī)則的、松散的，有一定程度的內(nèi)凹和折疊，并且能夠觀察到微小空洞的出現(xiàn)。出芽短梗霉細(xì)胞膜形態(tài)發(fā)生變化可能是因?yàn)橥聹?0與膜磷脂雙分子中的脂質(zhì)部分發(fā)生了相互作用[10]。

圖6 透射電鏡結(jié)果圖Fig.6 Transmission electron microscope results

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)不同表面活性劑對(duì)出芽短梗霉生長(zhǎng)和PMLA生產(chǎn)的影響各不相同，SDS和曲拉通X-100對(duì)PMLA的合成有抑制作用，不利于PMLA的合成。吐溫80和吐溫60在低濃度時(shí)有利于PMLA的合成，最適添加量都是2 g/L，吐溫80比吐溫60的作用效果更好。添加吐溫80后，PMLA的產(chǎn)量為31.36 g/L，較對(duì)照組提高了30.5%。選擇吐溫80作為最佳影響因子時(shí)，胞內(nèi)脂肪酸含量檢測(cè)結(jié)果顯示，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比率提高，這使得細(xì)胞膜的流動(dòng)性增強(qiáng)；同時(shí)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變得松散，通透性增強(qiáng)，有利于PMLA往胞外分泌。