屈頭雞果預(yù)灌胃對哮喘小鼠氣道Th1/Th2型細(xì)胞因子水平的調(diào)節(jié)作用

趙展慶,張萬科,符妹垂，周小敏,余秉昌，林奇棟

(1海南西部中心醫(yī)院，海南儋州 571799；2海南醫(yī)學(xué)院)

哮喘發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢，已成為一個嚴(yán)重的世界性社會公共衛(wèi)生問題[1]。基于對氣道炎癥是哮喘的本質(zhì)這一認(rèn)識，傳統(tǒng)抗炎藥物糖皮質(zhì)激素被認(rèn)為是目前最有效的哮喘治療藥物。然而，糖皮質(zhì)激素治療過程中的諸多毒副作用不同程度地影響其在臨床中的應(yīng)用。屈頭雞是生長在海南少數(shù)民族山區(qū)的一種植物。現(xiàn)有的資料認(rèn)為，屈頭雞果具有治療咳嗽、哮喘的功效[2]，但尚無相關(guān)的觀察和研究證實。目前國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，Th1細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子如IL-2、IL-10、IFN-γ，可減輕哮喘的氣道炎癥，抑制哮喘發(fā)作；而Th2細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-6和IL-13等，則可加重哮喘的氣道炎癥，引發(fā)哮喘。2017年1～12月，本課題以屈頭雞果果漿灌胃干預(yù)哮喘小鼠，觀察在治療劑量和中毒劑量下，哮喘氣道炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IL-10、IFN-γ以及IL-4、IL-5的變化，以明確其是否有抑制氣道炎癥的作用，并探討其可能的機(jī)制，為今后屈頭雞果在哮喘中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要儀器與試劑 雌性SPF級BALB/c純系小白鼠50只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量16～20 g，由海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。所有小鼠飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，SPF級實驗室。屈頭雞果(海南本地產(chǎn)植物)；卵蛋白(美國SigmaⅤ級，純度>98%)；氫氧化鋁凝膠(廣州化學(xué)試劑廠)；地塞米松注射液(廣州白云山天心制藥股份有限公司)；IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ ELISA試劑盒(上海川翔科技有限公司)；臺式高速離心機(jī)(上海安奇科學(xué)儀器廠)；酶標(biāo)儀(美國Genecore公司)。

1.2 小鼠哮喘模型制備及屈頭雞果用法 將50只小鼠隨機(jī)分為正常對照組(A組)、哮喘模型組(B組)、屈頭雞果治療劑量組(C組)、屈頭雞果中毒劑量組(D組)、地塞米松治療組(E組)5組，每組10只。A組第0、14天腹腔注射0.2 mL生理鹽水，第24天以生理鹽水10 mL霧化，每天30 min，連續(xù)28天。B組第0、14天腹腔注射0.2 mL致敏液(含卵白蛋白100 μg、氫氧化鋁凝膠400 μg)，第24天以1%卵蛋白溶液10 mL霧化激發(fā)哮喘，每天30 min，連續(xù)28天。C組以上述同樣方法用卵蛋白進(jìn)行致敏和激發(fā)小鼠，在每次霧化激發(fā)哮喘前30 min灌胃屈頭雞果果漿2.16 g/kg[2]。D組以上述同樣方法用卵蛋白進(jìn)行致敏和激發(fā)小鼠，在每次霧化激發(fā)哮喘前30 min灌胃屈頭雞果果漿10.8 g/kg[3]。E組以上述同樣方法用卵蛋白進(jìn)行致敏和激發(fā)小鼠，在每次霧化激發(fā)哮喘前30 min腹腔注射地塞米松2 mg/kg。

1.3 小鼠肺泡灌洗液Th1、Th2型細(xì)胞因子水平檢測 在末次激發(fā)結(jié)束后30 min，所有小鼠以水合氯醛腹腔注射麻醉，放血處死。開胸，剪開頸部皮膚暴露氣管，用頭皮針在頸部行氣管插管并以絲線結(jié)扎固定；結(jié)扎右肺，經(jīng)氣管套管向左肺緩慢注入生理鹽水0.5 mL，邊按摩胸部邊回收液體，反復(fù)抽吸3次，回收率80%以上。將取得的肺泡灌洗液取20 μL用以細(xì)胞計數(shù)，剩余放入離心管中，10 000 r/min，離心后留取上清液分裝于Eppendoff管，進(jìn)行IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ水平的ELISA檢測。

2 結(jié)果

末次激發(fā)結(jié)束時A組、B組、C組及E組小鼠均存活，D組小鼠在給藥的過程中先后死亡4只，存活的6只也存在不同程度嘔吐、腹瀉、心律加快和抽搐等癥狀。各組小鼠肺泡灌洗液Th1、Th2型細(xì)胞因子水平比較見表1、2。

表1 各組小鼠肺泡灌洗液Th1型細(xì)胞因子

注：與A組比較，★P<0.01；與B組比較，△P<0.05；與E組比較，#P<0.05，*P<0.01。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液Th2型細(xì)胞因子水平

注：與A組比較，★P<0.01；與B組比較，△P<0.05，與E組比較，#P<0.05。

3 討論

當(dāng)致敏原經(jīng)呼吸道或其他途徑進(jìn)入機(jī)體，機(jī)體在接觸致敏原后，激活T淋巴細(xì)胞并使其分別分化為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞可釋放多種IL，參與哮喘的調(diào)節(jié)。Th1/Th2細(xì)胞的比例和功能失衡，在哮喘發(fā)病過程中扮演著重要的角色[4]。

目前認(rèn)為，Th1細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子可減輕哮喘的氣道炎癥，抑制哮喘發(fā)作。Th1細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，如IL-2、IL-12、IFN-γ，能抑制IgE合成，并抑制IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)，在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中起負(fù)向調(diào)節(jié)的作用，在哮喘的發(fā)病機(jī)制中，起到對抗、抵消Th2細(xì)胞，以達(dá)到平衡的作用[5]。

Th2細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子則可加重哮喘的氣道炎癥，促發(fā)哮喘。Th2細(xì)胞主要釋放IL-4、IL-5、IL-6和IL-13等細(xì)胞因子。IL-4可促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化，形成漿細(xì)胞，產(chǎn)生IgE。IgE與嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞表面的高親和性的IgE受體結(jié)合。當(dāng)過敏原再次進(jìn)入體內(nèi)，即可與嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞表面結(jié)合的IgE結(jié)合，并促使該細(xì)胞合成及釋放多種炎癥介質(zhì)，使氣道平滑肌收縮，黏液分泌增多，氣道黏膜水腫，血管通透性增強，導(dǎo)致哮喘發(fā)作[6]。IL-5則可調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的增殖、分化，并且，還可通過上調(diào)黏附分子VCAM-1，使中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞向血管內(nèi)皮遷移并黏附于血管內(nèi)皮。IL-5不但能促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的增殖和分化，而且還能進(jìn)一步促使其激活[7]。除此以外，Shi等[8]的研究結(jié)果表明，IL-5還能起到趨化作用，募集嗜酸粒細(xì)胞浸潤到哮喘患者呼吸道，并且激活浸潤在呼吸道中的嗜酸粒細(xì)胞。因此，Th2型細(xì)胞因子如IL-4和IL-5常作為人們研究哮喘氣道炎癥的重要標(biāo)志物。

目前糖皮質(zhì)激素被認(rèn)為是防治哮喘最有效的藥物。糖皮質(zhì)激素能抑制氣道炎癥反應(yīng)，有效地控制許多哮喘患者的癥狀。但是對于部分難治性哮喘、激素依賴性哮喘以及重癥哮喘，糖皮質(zhì)激素療效欠佳[9]。另外，糖皮質(zhì)激素的毒副作用也不同程度地影響其在臨床中的應(yīng)用[10]。因此，人們嘗試尋找一些有效且不良反應(yīng)少的抗炎藥物。屈頭雞是一種生長在海南、廣東和廣西等我國南方省份山區(qū)的中草藥。根據(jù)《全國中草藥匯編》顯示[2]，屈頭雞果可入藥，性味甘平，口感頗佳，具有療肺止咳、生津利喉、解毒清肝功效，用于咳嗽、哮喘，但成年人每日用量為1～2個，不可過量，以防中毒。迄今為止，國內(nèi)外有關(guān)屈頭雞果藥用價值的文獻(xiàn)資料極少，現(xiàn)存的文獻(xiàn)也主要是針對其食入過量導(dǎo)致中毒的報道[3]，目前尚無屈頭雞果治療哮喘的報道。

本研究顯示，屈頭雞果灌胃預(yù)處理對哮喘小鼠氣道IL-4、IL-5等Th2型細(xì)胞因子具有抑制作用，并可激活I(lǐng)L-2、IL-10、IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子，提示屈頭雞果對哮喘氣道炎癥具有一定的防治作用，這種防治作用可能是通過抑制Th2型細(xì)胞因子、激活Th1型細(xì)胞因子來實現(xiàn)的。屈頭雞果對于哮喘氣道炎癥的抑制作用上，在某些方面雖不及傳統(tǒng)的抗炎藥物糖皮質(zhì)激素，但仍具有進(jìn)一步發(fā)掘的藥用價值。實驗同時也顯示，屈頭雞果的治療劑量和中毒劑量對氣道炎癥的抑制作用并無顯著性差異，但中毒劑量則可導(dǎo)致動物死亡，因此不宜過量食用屈頭雞果。鑒于屈頭雞果有一定毒性，因此目前尚不建議應(yīng)用于臨床。對于屈頭雞果確切的有效藥理成分與毒性成分，仍有待今后進(jìn)一步深入研究。