姜黃素灌胃對動脈粥樣硬化大鼠血管內皮損傷的逆轉作用及其機制

艾詩媛，張英

(西南醫科大學，四川瀘州 646000)

動脈粥樣硬化(AS)易累及冠狀動脈、頸動脈等，由AS所致的心、腦血管不良事件已經成為當前人類的首要死亡原因。大量研究表明，眾多致AS的危險因素(如吸煙、高血壓、糖尿病、脂代謝紊亂以及血液流變學改變、缺氧、感染等)都能引起炎癥及氧化應激并導致內皮損傷與功能障礙，而炎癥、氧化應激、血管內皮損傷正是AS的幾個顯著特征[1]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)是常用于反映炎癥的指標，丙二醛(MDA)及總抗氧化能力(T-AOC)是反映抗氧化能力及氧化應激損傷程度的指標。血管內皮在維持血管穩態過程中發揮著重要作用，血管內皮不僅是一個屏障更是一個復雜的旁分泌器官，參與調節細胞生長、血管張力、血小板和白細胞與血管壁的相互作用等。內皮損傷可使LDL-C大量沉積于內膜下，LDL-C經氧化修飾成ox-LDL后被單核-巨噬細胞吞噬形成泡沫細胞，從而開啟AS過程，還可導致血管舒、縮功能失常并促發血栓形成，從而引發心血管事件。可見，抑制炎癥與氧化應激、保持血管內皮完整與功能正常是防治AS的重要措施[2,3]。事實上，與AS斑塊一旦形成便難以消退不同，血管內皮損傷與功能障礙是可以完全逆轉的。循環中NO含量、內皮細胞數量是常用于反映血管內皮功能及內皮損傷的指標。血紅素氧合酶-1(HO-1)是細胞內一種可誘導的抗氧化酶，其過表達可有效拮抗炎癥和氧化應激所致的組織與細胞損傷[4]。姜黃素是HO-1的天然誘導劑，能在基因水平誘導HO-1轉錄與表達[5]，但姜黃素能否通過誘導HO-1過表達逆轉AS患者血管內皮損傷與功能障礙卻鮮見報道。2015年1月～2017年12月，本實驗擬在大鼠AS模型上對此進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠32只，3月齡,體質量(200±20)g，由西南醫科大學動物中心提供，在西南醫科大學動物實驗室喂養。丙基硫氧嘧啶、膽酸鈉及膽固醇購自上海藍季科技發展有限公司，基礎飼料由西南醫科大學醫學動物中心提供。高脂飼料配制：0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、3%膽固醇、5%白糖、10%豬油(自制)、81.3%基礎飼料。主要試劑：維生素D3注射液及姜黃素購自大連美侖生物技術有限公司，卵清白蛋白干粉、牛血清白蛋白干粉及HO-1蛋白活性的特異性抑制劑鋅原卟啉Ⅸ(ZnPPⅨ)購自Sigma公司，硫酸亞鐵購自天津市光復科技發展有限公司，TNF-α、IL-6及NO檢測試劑盒購自Abcam公司，HO-1免疫組化檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，MDA、T-AOC檢測試劑盒購自南京建成生物研究所。CD31抗體購自BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及AS模型制備 32只健康雄性SD大鼠給予基礎飼料適應性喂養1周后開始造模。大鼠隨機均分為對照組、模型組、姜黃素組和姜黃素+ZnPPⅨ組。各組采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，沿頸前正中線切開皮膚，分離右側頸總動脈并阻斷血流后，除對照組外的其余三組大鼠均用液氮冷凍該段血管15 s造成內皮損傷，恢復血流后縫合傷口，給予高脂飼料喂養，并予腹腔注射維生素D3(首次60萬IU/kg，之后每周10萬IU/kg)，同時注射異種蛋白刺激免疫反應(背部皮下注射牛血清白蛋白40 mg/kg，每周3次，共3周；腹腔注射卵清白蛋白2.5 mg/kg，每3天1次，共5次)，另在飲水中加入FeSO4(25 mg/100 mL)。對照組僅分離右側頸總動脈而不予液氮冷凍損傷，持續喂養普通飼料并按其余三組相同的時間及操作方式處理，但所用藥物均代之以生理鹽水。

1.2.2 藥物干預 從造模開始第14周，姜黃素組給予姜黃素100 mg/(kg·d)灌胃，姜黃素+ZnPPⅨ組給予姜黃素100 mg/(kg·d)灌胃及腹腔注射ZnPPⅨ 7.5 mg/kg隔日1次。模型組及對照組給予2 mL生理鹽水灌胃和1 mL生理鹽水腹腔注射。干預時間共2周。

1.2.3 標本采集 干預結束后，各組大鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經腹主動脈采血檢測各項生化指標及循環內皮細胞數量。處死動物取右側頸總動脈用于HE染色和免疫組化檢測HO-1蛋白表達。

1.2.4 頸總動脈組織學觀察 所取血管組織按常規操作方法經中性甲醛固定、石蠟包埋、切片、脫水、透明、HE染色，光鏡下觀察組織學變化。

1.2.5 血清TNF-α、IL-6、T-AOC、MDA、NO水平檢測 采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6，比色法檢測T-AOC及NO，TAB法檢測MDA，操作嚴格按照相應試劑盒說明書進行。

1.2.6 循環內皮細胞數量測算 采用流式細胞儀檢測。取外周血分離單個核細胞，調整細胞密度，吸取適量細胞懸液于1.5 mL EP管中，離心收集細胞，加入100 μL PBS混勻后，加入CD31抗體，吹打混勻，避光孵育30 min后加入500 μL PBS緩沖液洗滌2次，1 200 r/min離心5 min收集細胞，再加入400 μL PBS重懸細胞，上機檢測。用CD31陽性細胞占單個核細胞總數的百分比代表循環內皮細胞數量。

1.2.7 血管組織HO-1蛋白表達檢測 采用免疫組織化學染色。取各組大鼠右側頸總動脈，用石蠟包埋，制作切片，常規脫水透明，3% H2O2溶液室溫避光10 min滅活內源性過氧化酶，抗原修復液加熱修復，冷卻后加5% BSA室溫靜置20 min，滴加HO-1一抗(1∶300)4 ℃過夜。滴加二抗，室溫靜置20 min，加SABC室溫20 min，DAB顯色8 min，蘇木精染液染色5 min，脫水透明后中性樹膠封片保存。光鏡下觀察，胞質呈棕褐色者為HO-1蛋白表達陽性細胞。采用Image Proplus多媒體彩色病理圖像分析軟件進行分析，計算每例切片3個不重疊的400倍視野中陽性染色的累積光密度值，以其代表HO-1蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組頸總動脈病理組織學改變 光鏡下HE染色顯示，對照組血管內皮光滑完整；中膜可見梭形平滑肌細胞，彈力纖維層結構清晰完整，未見泡沫細胞。模型組動脈壁明顯增厚，可見局部管壁向管腔突出，內皮下有大量泡沫細胞聚集；中膜平滑肌細胞增生，排列紊亂。姜黃素組動脈粥樣硬化病變明顯減輕，內皮覆蓋完整。姜黃素+ZnPPⅨ組動脈粥樣硬化病變與模型組相似甚至還有所加重。

2.2 各組血清TNF-α、IL-6、MDA、T-AOC水平比較 見表1。

表1 各組血清TNF-α、IL-6、T-AOC、MDA水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與姜黃素組比較，ΔP﹤0.05。

2.3 各組血清NO水平及循環內皮細胞數量比較 見表2。

表2 各組血清NO水平及循環內皮細胞數量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與姜黃素組比較，ΔP﹤0.05。

2.4 各組血管組織內HO-1蛋白表達比較 對照組、模型組、姜黃素組、姜黃素+ZnPPⅨ組血管組織內HO-1蛋白表達分別為11 992.8±701.5、18 333.6±904.4、40 603.2±2 029.1、37 069.8±1 535.3，模型組、姜黃素組、姜黃素+ZnPPⅨ組與對照組相比，姜黃素組、姜黃素+ZnPPⅨ組與模型組相比，P均<0.05。

3 討論

大鼠常用于制備與人體病變相似的AS模型，但大鼠先天具有較強的抗AS能力，為此，我們對文獻報道的多種造模方法[6～8]進行了綜合與改良：即在常規高脂飼養基礎上加用丙基硫氧嘧啶和維生素D3等藥物以減少脂質消耗并促進脂質及鈣對血管壁的侵入和沉積，同時用液氮冷凍損傷血管內皮，再結合皮下注射異種蛋白激發免疫性炎癥反應并于飲水中加入FeSO4以增加氧化應激等。結果顯示：模型組頸動脈管壁增厚，結構紊亂，內皮不完整，其下有大量泡沫細胞堆積，并有淋巴細胞或巨噬細胞浸潤，表明AS模型制備成功。本實驗中，模型組較對照組血清TNF-α、IL-6、MDA水平明顯升高而T-AOC明顯降低，且循環內皮細胞數量明顯增加以及血清NO水平明顯降低，表明模型組大鼠體內存在明顯的炎癥與氧化應激反應并伴血管內皮細胞顯著損傷及功能障礙。這與臨床研究[9]顯示冠心病患者體內也存在著炎癥與氧化應激和血管內皮損傷與功能障礙是相似的。鑒于內皮損傷與AS及相關的心血管不良事件密切相關，探討有效逆轉AS模型大鼠血管內皮損傷與功能障礙的方法對臨床防治冠心病具有借鑒意義。

姜黃素是從姜黃屬類植物根莖中提取的一種多酚化合物，其藥理機制復雜并具有多重細胞保護作用，包括抗炎、抗氧化、抗病毒、抑制AS等[10]。近年發現，姜黃素是HO-1的天然誘導劑，可通過活化核因子相關因子2/抗氧化劑反應元件(Nrf2/ARE)這一特殊的細胞內信號轉導途徑在基因轉錄水平誘導HO-1表達[5]。本研究中的姜黃素組、姜黃素+ZnPPⅨ組血管組織內HO-1表達均有顯著增加則再次印證了這一點。研究發現，姜黃素的許多藥理學作用可能主要是通過誘導HO-1表達介導的[5，11]。本研究結果顯示，姜黃素組較模型組血清TNF-α、IL-6、MDA水平明顯降低而T-AOC明顯升高，對應的循環內皮細胞數量明顯減少同時血清NO水平明顯升高，表明姜黃素有效地發揮了抗炎、抗氧化及保護血管內皮等作用。但姜黃素+ZnPPⅨ組以同樣的方法使用姜黃素，其炎癥與氧化應激指標卻遠高于姜黃素組而與模型組相近，在減輕血管內皮損傷的效果上也明顯不如姜黃素組，表明ZnPPⅨ能阻斷姜黃素的抗炎癥、抗氧化應激與保護血管內皮等作用，由于ZnPPⅨ是HO-1蛋白活性的特異性抑制劑，提示姜黃素的上述作用主要是通過誘導HO-1過表達實現的。

研究發現，HO-1是存在于細胞內的一種可誘導型抗氧化酶，基礎表達水平較低，但各種致細胞損傷和應激的理、化因素均可誘導其迅速表達。HO-1蛋白的主要生物學功能是催化細胞內游離血紅素降解生成膽紅素與一氧化碳(CO)等產物。其中，膽紅素是一種細胞內源性強抗氧化劑，能清除多種形式的自由基而發揮抗氧化應激性細胞損傷作用；CO則是與NO類似的又一細胞內氣體信號分子，廣泛參與擴血管、調節免疫、抑制炎癥、調控細胞增殖與凋亡等過程。HO-1/膽紅素/CO組成的內源性保護系統在組織細胞應對炎癥和氧化應激損傷中不可或缺，合理上調HO-1表達是包括AS在內的許多疾病的防治措施[4,12]。由此推測，膽紅素和CO是姜黃素誘導HO-1表達逆轉AS血管內皮損傷的主要效應分子。盡管各種損傷性理、化因素所致的氧化應激都有可能引起HO-1適應性表達，但許多病理狀態下的HO-1適應性表達水平有限，尚不足以對抗致病因素所造成的損傷[13]。本研究也證實了這一點，即模型組致AS的損傷因素雖然也在一定程度上誘導了HO-1表達，卻未能阻止血管內皮損傷及功能障礙，而應用姜黃素高效誘導HO-1過表達則能顯著抑制AS大鼠業已升高的炎癥與氧化應激水平，逆轉受損的血管內皮細胞功能，這一結果為姜黃素在AS性心血管疾病防治中的應用奠定了基礎。