CRP基因沉默后心肌細胞系H9c2的miR-21及其靶基因表達、細胞活力觀察

程玲慧，余麗霞，葉鳳英，權磊，譚文

(1華南理工大學生物科學與工程學院，廣州 510006；2華南理工大學醫學院；3廣東工業大學生物醫藥研究院)

缺血性心臟病是全世界致死率最高的疾病之一[1]。缺血缺氧會造成心肌細胞不可逆轉的損傷和壞死，并引起一系列劇烈的炎癥反應[2]。受損的心肌組織通過炎癥細胞清除傷口碎片，然而持續的炎癥反應會進一步加重心肌細胞的凋亡。C反應蛋白(CRP)是一類急性反應蛋白，在感染、炎癥或組織損傷的刺激下由肝臟快速合成[3]。在臨床實踐中，CRP一直被公認為重要的心血管疾病非特異性生物標志物。近來研究發現，以特異性的反義核苷酸降低大鼠血漿中CRP水平可以有效減少心肌梗死的面積[4]。相反地，對發生心肌梗死的小鼠皮下注射CRP可以增加心肌梗死面積，擴大心電圖ST段的上升幅度[5]。CRP不僅可用于臨床上對心血管疾病的早期診斷、篩查，還可作為功能性因子實質地參與心血管疾病病理變化，具有治療相關疾病的潛能。然而，目前尚無研究直接證明CRP對心肌細胞的表型或內在分子通路產生影響。2016年6月～2018年2月，本研究通過慢病毒介導體外沉默H9c2心肌細胞的CRP基因，利用實時定量PCR分析細胞中miR-21及其下游靶基因PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA的表達，探討沉默CRP基因對H9c2心肌細胞中miR-21及其下游靶基因的調控作用，研究體外沉默CRP基因對H9c2心肌細胞活力的影響，為臨床上治療心血管疾病提供分子基礎。

1 材料

實驗所用H9c2心肌細胞購自中國科學院上海細胞所。胎牛血清、DMEM培養基和胰酶均購自Gibco公司，嘌呤霉素購自索萊寶科技有限公司。輔助包裝質粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G及轉染劑Polybrene由賽業生物科技有限公司提供。ArctutusTMPicopureTMRNA Isolation Kit、TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit、TaqMan?Universal Master Mix、superscript?Ⅲfirst-strand synthesis supermix for RT-qPCR和power upTMSYBR?green master mix試劑盒均購自賽默飛世爾生物公司。

2 方法與結果

2.1 沉默CRP基因載體構建與慢病毒包裝 沉默CRP基因的慢病毒載體及技術支持由賽業生物科技有限公司提供。慢病毒包裝采用四質粒包裝系統，按說明書將1種表達質粒與3種輔助包裝質粒共轉染293T細胞。轉染6 h后更換新鮮培養基；轉染48 h后，收集病毒上清，按1 mL/支分裝所獲得濃縮的病毒顆粒，于-80 ℃長期保存。將濃縮的病毒顆粒按10倍倍比稀釋后分別感染293T細胞，感染24 h后，更換新鮮培養基繼續培養48 h，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況并計算病毒滴度。

2.2 H9c2心肌細胞的培養 以15% FBS的高糖DMEM培養基，于5% CO2、37 ℃培養箱中培養H9c2心肌細胞。當細胞貼壁70%～80%時，用0.08%胰酶消化約1 min，計數，以1∶2的比例傳代，大約3天傳代1次。取對數生長期的細胞，按3×105/孔的密度接種至6孔板內，每孔2 mL培養基，常規培養過夜。次日，細胞匯合度為50%左右，每孔細胞數約為1×106，則可以進行下一步慢病毒轉染。

2.3 慢病毒轉染H9c2心肌細胞 取上述待實驗的H9c2心肌細胞，分為CRP沉默組和對照組。根據計算的病毒滴度，按感染復數20的病毒細胞比例加入慢病毒顆粒，其中CRP沉默組轉染對CRP特異性沉默的pLV-shRNA-CRP慢病毒，對照組轉染無敲減作用的pLV-shRNA-Scramble慢病毒。按5 μg/mL的最終濃度滴加轉染劑Polybrene，轉染后的細胞培養條件和常規培養條件相同。轉染6 h后，若出現細胞毒性則立即更換新鮮培養基，若無則繼續培養；轉染12 h后，更換新鮮培養基。

2.4 慢病毒載體轉染H9c2心肌細胞的篩選與鑒定 轉染48 h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況，熒光率達到60%左右，加入含有0.25 μg/mL嘌呤霉素培養基進行篩選。嘌呤霉素篩選H9c2心肌細胞兩代左右，觀察細胞的熒光情況。H9c2心肌細胞可見大量綠色熒光顆粒，與同一視野下明場相比，表達綠色熒光蛋白的H9c2心肌細胞有80%以上，說明慢病毒已成功轉染H9c2心肌細胞。此時用PBS溶液清洗兩遍，收集細胞并利用實時定量PCR鑒定CRP基因的沉默效率。

2.5 H9c2心肌細胞CRP基因的沉默效率 采用實時定量PCR法檢測。按ArctutusTMPicopureTMRNA Isolation Kit說明書從心肌細胞中提取RNA。根據superscript?Ⅲ first-strand synthesis supermix for RT-qPCR說明書合成cDNA，并利用power upTMSYBR?green master mix進行實時定量PCR。CRP上游引物5′-GCTTCTCTCAGGCTTTTGGTCA-3′，下游引物5′-GTCCCCACAATGTAGCCCTT-3′；GAPDH 上游引物5′-TCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3′，下游引物 5′-ACACCGACCTTCACCATCT-3′。PCR反應條件：95 ℃ 2 min，循環1次；50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環40次；溶解曲線95 ℃ 15 s，60℃ 60 s，95 ℃ 15 s，循環1次。采用2-ΔΔCt法計算CRP mRNA相對表達量。CRP沉默組和對照組H9c2心肌細胞中CRP mRNA相對表達量分別為0.320±0.069、1±0.090，兩組相比P<0.01。表明沉默CRP基因的H9c2心肌細胞株篩選成功。

2.6 H9c2心肌細胞miR-21表達 采用實時定量PCR法檢測。按ArctutusTMPicopureTMRNA Isolation Kit說明書從心肌細胞中提取RNA，使用TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit進行逆轉錄，TaqMan?Universal Master Mix進行實時定量。miR-21/U6引物均由賽默飛世爾生物公司提供(miR-21 Assay ID：000397，U6 Assay ID：001973)。PCR反應條件：50 ℃ 2 min，循環1次；95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環40次。采用2-ΔΔCt法計算miR-21的相對表達量。結果顯示，CRP沉默組和對照組miR-21相對表達量分別為0.740±0.099、0.280±0.010，兩組相比P<0.01。

2.7 H9c2心肌細胞PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表達 采用實時定量PCR法檢測。按ArctutusTMPicopureTMRNA Isolation Kit說明書從心肌細胞中提取RNA。根據superscript?Ⅲ first-strand synthesis supermix for RT-qPCR說明書合成cDNA，并利用power upTMSYBR?green master mix進行實時定量PCR。所用引物由上海捷瑞生物公司合成。PDCD4上游引物5′-GAGGCAAGGGTGTCTGG-3′，下游引物5′-CGTATCTCCGTGCTCAAAG-3′；PTEN上游引物5′-TGGGAAAGGACGGACTG-3′，下游引物5′-CGCCTCTGACTGGGAAT-3′；Spry1上游引物5′-CCCAGGCTCTGCACTAGGTA-3′，下游引物5′-AGTCAGCGGAAATCTGCCAT-3′；GAPDH上游引物5′-TCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3′，下游引物5′-ACACCGACCTTCACCATCT-3′。PCR反應條件：95 ℃ 2 min，循環1次；50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環40次；溶解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，循環1次。采用2-ΔΔCt法計算PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA相對表達量。CRP沉默組的PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表達均低于對照組(P均<0.01)，見表1。

表1 兩組PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA

注：與對照組相比，*P<0.01。

2.8 H9c2心肌細胞活力檢測 采用MTT法檢測。按照每孔5×103的比例將H9c2心肌細胞接種于96孔板中。設置三個組別分別為空白組、對照組和CRP沉默組，每組設置4個復孔，并設置3次平行實驗。培養12 h后，空白組不轉染病毒加入等量的DMEM培養基，對照組轉染pLV-shRNA-Scramble慢病毒顆粒，CRP沉默組轉染pLV-shRNA-CRP慢病毒顆粒。轉染24 h后，取出96孔板，沿著各孔孔壁輕輕加入5 mg/mL的MTT原液10 μL，于37 ℃、5% CO2的培養箱中避光孵育4 h。4 h后取出96孔板，輕輕翻轉96孔板，將其倒扣在干凈的濾紙上棄掉含MTT的培養基并防止紫色甲臜也被棄掉。往96孔板各孔中加入100 μL DMSO，在室溫、避光條件下，溶解搖勻紫色甲臜結晶20 min。用多功能酶標儀測定570 nm波長處的吸光度，整理數據并進行分析。CRP沉默組、對照組和空白組細胞活力分別為0.78±0.030、0.66±0.010、1.00±0.013；與空白組相比，CRP沉默組和對照組細胞活力均下降(P均<0.01)；與對照組相比，CRP沉默組細胞活力上升(P<0.05)。

3 討論

缺血性心臟病是一種常見的心血管疾病，嚴重威脅人類健康。在心臟血流供應長期受損情況下，缺血級聯反應將被激發，心肌細胞因缺血缺氧發生不可逆的壞死，導致大量心肌細胞損失，嚴重影響了心臟功能。此時心肌成纖維細胞增生，導致形成，發生心室重塑，心功能下降，最終可能導致心力衰竭[6]。

臨床上，對CRP與冠心病、心肌梗死、心律失常等之間的關系有比較深入的研究，已證實CRP是心血管疾病非特異性的預測因子與危險因子[7]。CRP作為心血管疾病重要的炎癥介質，可以誘導黏附分子在內皮細胞中表達，并在動脈粥樣硬化的炎癥反應中起關鍵作用[8]。此外，CRP損害內皮祖細胞的血管生成功能并減弱其存活和分化。Nagai等[9]證實，CRP通過炎癥反應增強了壓力超負荷引起的心臟重塑。在CRP轉基因小鼠模型中，CRP在高血管緊張素Ⅱ條件下促進心臟纖維化和炎癥反應[10]。事實上，CRP可增加大鼠新生心肌細胞缺氧誘導的凋亡和一氧化氮產生，CRP與受損心肌細胞中暴露的配體結合可導致補體系統介導的組織損傷的惡化[11]。可見，CRP不再單純地用于臨床上對疾病的早期診斷、篩查，而作為功能性因子參與心血管疾病病理變化，具有治療相關疾病的潛能。miR-21是目前研究較為成熟的miRNAs之一[12]。miR-21的功能重要性很大程度上取決于其調控的靶基因。PDCD4、PTEN和Spry1是當前miR-21參與介導的缺血性心血管病的重要靶基因。PDCD4抑制與細胞增殖有關的轉錄因子的合成，從而抑制細胞存活[13]。Cheng等[14]發現，經過氧化氫處理過的心肌細胞中，PDCD4和miR-21表達明顯上調。miR-21以PDCD4的mRNA作為靶標，保護心肌細胞免受缺血再復灌損傷并提高其存活率[15]，在心肌細胞生長、死亡和心臟成纖維細胞功能中發揮重要作用[16]。PTEN最初作為一種腫瘤抑制因子而被發現，其自身具有磷酸酯酶特性可誘導細胞凋亡[17]。Lee等[18]在研究CRP對H9c2心肌細胞中生存素表達影響時發現，CRP可以顯著增加促凋亡因子PTEN表達量。Spry1是受體酪氨酸激酶途徑的保守抑制劑，可負向調控多條RTK信號途徑，進而抑制細胞生長、遷移[19]。

本實驗首次將炎癥因子CRP和影響心血管疾病進程的重要因子miR-21聯系起來，發現CRP沉默組較對照組miR-21相對表達量高，PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表達均低，證實沉默CRP基因可以增加H9c2心肌細胞中miR-21的表達，抑制PDCD4、PTEN和Spry1表達，與沉默CRP基因對miR-21的促進作用相呼應。本實驗還發現，CRP沉默組和對照組較空白組細胞活力均下降，CRP沉默組較對照組細胞活力上升，表明沉默CRP基因可以顯著增加H9c2心肌細胞活力。PDCD4和PTEN都是促凋亡因子，PDCD4抑制與細胞增殖有關的轉錄因子的合成；而PTEN可以抑制PI3K-Akt信號通路，調節細胞的增殖、凋亡以及遷移等。Spry1主要在心肌成纖維細胞中表達，在H9c2心肌細胞中Spry1 mRNA的表達量非常低。因此，H9c2心肌細胞活力的增加很可能和沉默CRP基因后PDCD4、PTEN表達下降有關。

綜上可見，沉默CRP基因可促進H9c2心肌細胞存活，這可能與其可增加H9c2心肌細胞中miR-21表達，抑制PDCD4、PTEN和Spry1的基因表達有關。因此，CRP具有開發新型藥物治療缺血性心血管病的潛能。沉默CRP基因可能有助于減少缺血性心臟病病發生過程中的心肌細胞凋亡，從而改善心肌梗死等缺血性心臟病的預后狀況，降低心肌缺血后一系列并發癥的概率。但本實驗只基于正常的H9c2心肌細胞，要進一步明確沉默CRP基因可以促進動物體內miR-21表達并對缺血性心臟產生保護作用，還需要建立CRP敲除動物模型和缺血模型進行更全面、深入的探究。