離子遷移質譜技術及其在脂質分析中的應用

吳邦富，魏 芳，謝 亞，徐淑玲，呂 昕，陳 洪

(中國農業科學院油料作物研究所，農業部油料加工重點實驗室，農業部油料作物生物學與遺傳育種重點實室，油料脂質化學與營養湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430062)

脂質是一類具有高度多樣性的生物分子，包含多種復雜脂質種類，脂質數據庫(LIPIDMAPS)最新數據顯示，確定結構的脂質分子(包括計算生成)多達4萬多種，這些脂質與其他物質共同構成生命體最基本的結構、具有能量儲存以及信號傳導等生物功能的分子網絡，并與人體的生理健康和代謝狀況息息相關，是炎癥[1]、癌癥[2-3]及內分泌失調[4]等諸多疾病的潛在生物標記物。因此，對生物樣本的脂質進行分析具有非常重要的生物學意義。

但脂質結構的多樣性以及同類脂質結構的相似性為脂質組學研究中的全脂質分析提出了巨大挑戰，傳統的脂質分析方法主要分為直接進樣(Shotgun mass spectrometry,Shotgun-MS)和液相色譜-質譜聯用(LC-MS)方法[5-6]，這兩種方法可以針對不同樣本需求進行較高選擇性和靈敏度的脂質分析。然而，與蛋白質或多肽等分子不同，大部分脂質分子的質量分布范圍極窄(0～1 000 Da)，相同或相近分子質量下存在大量的同分異構體，傳統的色譜分離技術很難對其進行分離。因此，為提高生物樣本中脂質鑒定的可信度，需建立一種可對脂質異構體進行分離的新技術。

離子遷移質譜技術(Ion mobility mass spectrometry,IM-MS)，或離子淌度質譜技術，是一種將離子遷移譜(Ion mobility spectrometry,IMS)與質譜(MS)串聯的新型二維技術[7]，與傳統的色譜-質譜串聯技術不同，它是將IMS置于離子源與質量分析器之間，利用電離后離子在遷移譜緩沖氣體或電力場中的遷移速率不同對離子進行篩選或分離，進入質譜后再按照質荷比進行分離和鑒定的技術。與單獨使用MS相比，IM-MS可以減少氣相離子中的干擾信號，從而提高譜圖清晰度、峰容量、選擇性和靈敏度。此外，這種新型技術還可與傳統色譜分離技術相結合，提供多一個維度的分離作用，提高目標檢測物的選擇性和專一性。近年來，該技術得到了迅猛發展，已被廣泛用于蛋白質[8-10]和代謝物[11-12]等生物大分子的分析中，尤其是在異構體物質分離、結構表征以及構象動態學方面展現出強大的應用潛力[13]。本文介紹了幾種常見的IMS技術及其結構和原理，對IM-MS聯用技術在脂質分析方面的應用進行綜述，并對其未來發展方向進行了展望。

1 離子遷移譜與離子遷移質譜技術概述

1.1 離子遷移譜的分類、結構及原理

離子遷移譜是根據離子遷移率不同對離子進行分離的技術，單獨的IMS也需配置一個電離源、分離室以及離子檢測器[14]。IMS與MS的根本區別在于MS中對離子的分離幾乎在真空條件下進行，而IMS則根據離子與緩沖氣體的碰撞頻率或差分電壓實現離子的分離[14]。IMS根據其分離原理和結構可分為不同的類型。

1.1.1漂移時間離子遷移譜漂移時間離子遷移譜(Drift time ion mobility spectrometry,DTIMS)是分離電離離子最傳統的設備，其分離室由一系列堆疊的環形電極組成(圖1A)，沿漂移管軸線產生均勻連續的電場，樣品離子通過離子門(每50～200 μs開1次)后形成離子群，然后在電場力作用下通過分離室，而中性氣體(主要是氮氣、氦氣或氬氣)的逆流從檢測區的一側引入，與樣品離子發生碰撞，不同離子具有不同的碰撞截面(CCS)，受到的碰撞力不同，從而到達離子檢測器的時間(DT)也不同[7]。在整個分離過程中，樣品中的非電離組分被漂移氣體移出漂移區。因緩沖氣體密度以及電場強度均為靜態，且漂移管長度也已知，所以DTIMS可以提供最高精度的離子遷移率測量，具有很高的分析分辨率。但由于離子氣體擴散造成的離子損失較大，因此DTIMS的靈敏度較低[15]。

1.1.2行波離子遷移譜行波離子遷移譜(Travelling wave ion mobility spectrometry,TWIMS)與 DTIMS原理類似，但不同于其恒定電場，TWIMS的電場是與離子運行方向平行的交變電場(圖1A)。其分離室由一系列疊層環離子導軌組成，然后在相鄰環形電極上施加一個反相射頻電壓(RF)，除產生使離子軸向運動的推動力外，還會對離子產生一種徑向約束力以減少離子擴散，提高離子的傳輸效率[15-16]。通過改變移動電壓波的速度和大小，可以實現離子的遷移率分離。

1.1.3場不對稱離子遷移譜/差分離子遷移譜與前兩種IMS分離原理不同，場不對稱離子遷移譜(Field asymmetric ion mobility spectrometry,FAIMS)，或稱為差分離子遷移譜(Differential mobility spectrometry,DMS)通常由兩塊平行的平板或同軸的圓筒電極組成(圖1B)，兩電極之間施加非對稱波形的射頻電壓。離子除了在氣流方向運動外，還在射頻電場作用下沿著與載氣垂直的方向做上下振蕩運動。由于高低場離子遷移率系數的不同，在每個射頻電場周期內，離子均會在垂直氣流方向上產生一個位移，經過多個周期后離子會在上下極板上湮滅。如果在高頻電場上施加匹配的補償電壓(CV)，使離子在垂直氣流方向上的總位移小于其初始位置到極板的距離，則離子可以通過漂移室到達檢測端[15,17]。在FAIMS/DMS中，通常以CV表征不同的離子。由于離子在軸向方向上僅受氣流的作用，DMS能夠實現正負離子的同時分離和檢測。

1.1.4俘獲離子遷移譜俘獲離子遷移譜(Trapped ion mobility spectrometry,TIMS)的工作原理與傳統離子遷移譜相反。TIMS是利用非均勻電場使離子在流動的氣體中保持靜止狀態，此時離子受到的氣體漂移力作用被電場力抵消，而離子群依據其尺寸與電荷的比值大小分離[18]。TIMS的通道類似漏斗(圖1C)，主要由漏斗型入口、遷移率分析區以及漏斗型出口三部分構成。帶電離子首先通過漏斗型入口富集后隨氣流注入遷移率分析區(第一步：離子注入)。離子遷移率分析區由一系列施加RF電壓的電極組成，沿軸線方向分布著隨距離增大而增大的電場。注入的不同離子在尺寸和所帶電荷上存在差異，因此受到的氣流漂移力也不同，當電場力增至與離子所受漂移力相同時，則離子在該區域停止，故不同離子會停留在不同的軸向位置(第二步：分離)。當調節電場力減小時，離子群會根據各自尺寸與電荷之比從大到小依次從出口釋放，到達檢測器(第三步：釋放)[15]。雖然TIMS的工作原理與傳統DTIMS相反，但其物理原理相同。因此，前述的CCS同樣適用于TIMS[18]。

圖1 4種常見的離子遷移譜結構示意圖Fig.1 Schematics of 4 common kinds of ion mobility spectrometry A：DTIMS and TWIMS; B：FAIMS/DMS; C：TIMS

1.2 離子遷移質譜技術

盡管單獨的IMS可以提供關于分析物尺寸、形狀以及電荷等用于鑒定目標物的有用信息，但對于精準判斷分析物的信息(如離子的質量、結構等)仍很難得到。MS也是一種利用電場分離離子的技術，具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快、分離和鑒定同時進行等優點。電噴霧電離、基質輔助激光解吸電離和大氣壓化學電離等軟電離技術的出現，使得生物大分子的MS分析成為可能，并開發出一種新的質譜——生物質譜，且在生命科學領域得到廣泛應用[19]。IM-MS技術結合了二者的優點，且IMS的分離原理與傳統色譜完全不同，因此IM-MS可以很好地與色譜技術聯用，進一步提高分析物的檢測靈敏度以及線性范圍[20]。另外，由于分析物離子在進入質譜質量分析器之前首先在IMS中得到了一定的分離，一些雜質離子被緩沖氣體吹出分離室或打到電極板上，因此MS分析的信噪比及峰容量得到了提高[21-22]。Arthur等[22]使用場不對稱離子遷移譜與液相色譜質譜聯用(LC-FAIMS-MS)分析尿液樣本中代謝物時，由于背景信號的減少，其峰容積比LC-MS提高了3倍。同時，雜質離子的減少也簡化了MS譜圖，降低了后期解譜和數據處理的復雜性。

2 離子遷移質譜技術在脂質分析中的應用

對實際樣本中復雜脂質分子進行全面的定性定量分析是脂質組學研究中最重要和最基礎的內容。目前，最常見的脂質定性定量分析方法主要有兩種：①將簡單前處理的分析樣品直接進行質譜分析(Shotgun-MS)；②對前處理好的樣品先進行色譜分離再進行質譜分析(LC-MS)。這兩種方法已被廣泛應用于動植物[23-25]、微生物[26]及人[27-28]等各種樣本中的脂質分析，并且在脂質鑒定過程中通常會與串聯質譜技術(MS/MS)聯用，如碰撞誘導解離或高能碰撞解離，從而可以根據碰撞后不同模式下產生的特征離子碎片判斷每種待測脂質的酰基鏈和頭部基團。Shotgun方法具有前處理簡單、分析時間短和掃描模式豐富靈活等優點，應用較為廣泛。但由于其存在離子化抑制效應且不同類別脂質的含量差異較大，導致低豐度脂質很難檢測。液相色譜根據脂質的疏水性或極性可以實現較好的脂質分離效果[29-30]，但其分離時間較長，一般需數十分鐘，甚至數小時，并且對某些脂質的分離效果差，易出現共洗脫。IM-MS分離時間極短(ms)，與傳統脂質分析方法聯用(圖2)，不僅可以大大縮減脂質分離時間，且對一些結構相似的同分異構體脂質有非常好的分離效果。IM-MS在脂質分析方面的應用主要包括提高脂質分析選擇性和分辨率以及分離鑒定同分異構體兩個方面。

圖2 IMS與傳統脂質分析方法聯用的工作流程圖Fig.2 Workflow of IMS combined with traditional lipidomic approaches

2.1 提高脂質分析的選擇性與分辨率

在傳統脂質鑒定流程中，主要通過將測定的脂質分子質量數與數據庫中標準質量數或標準品進行匹配實現脂質分子的確定，脂質分子的結構信息則通過二級特征離子碎片信息判斷。但生物樣品復雜的基質以及脂質分子種類繁多成為限制這些技術應用的主要障礙。因此需更多與脂質分子物理化學性質相關的參數作為鑒定不同脂質分子的參考指標。

2.1.1DT值或CCS值脂質離子的CCS值代表脂質離子與緩沖氣體之間可以發生碰撞的有效面積[31]。在DTIMS、TWIMS和TIMS儀器中，CCS值常被用作分離脂質離子的參數，該值與脂質離子自身的尺寸、形狀及所帶電荷緊密相關，可看作是脂質離子固有的物理化學特性，與實驗條件及設備差異無關[32]。在傳統帶有均勻電場的DTIMS中，可直接由DT值計算得到CCS值；而在TWIMS等儀器中，則通過已知CCS值標準品的DT值計算得到CCS值[33]。一些較先進的儀器能夠自動完成計算過程并直接顯示測定物質的CCS 值[34-35]。

不同脂質離子因其碳鏈長度、雙鍵數以及空間構象不同而具有不同的DT值或CCS值。2009年，Kim等[36]利用TWIMS串聯正交加速飛行時間質譜(oa-TOFMS)測定了氮氣氣氛下質量數范圍為400～1 000 Da的磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)的質荷比(m/z)與DT之間的關系，發現飽和PC的m/z與DT之間存在線性關系，且PC酰基鏈上的不飽和鍵會導致DT值減小5%，每增加1個不飽和鍵，DT值會減少1%。Zhang等[37]在脂肪酸(Fatty acids,FAs)的CCS測定中也發現了類似規律，他們利用一個內嵌有漂移管的電噴霧飛行時間質譜(ESI-IM-QTOF)測定了18種FAs的CCS值。結果發現在飽和脂肪酸中,其CCS值與m/z呈線性關系。而雙鍵的增加則會減小FAs的CCS值，但影響比酰基鏈長度要小。其原因為雙鍵的存在會使酰基鏈在電場中呈彎曲結構，從而使CCS值減小。同時他們還發現順式脂肪酸異構體的CCS值小于同種反式異構體。除碳鏈長度和雙鍵數外，脂質離子的空間構象對其CCS值也有非常大的影響，不同種類的脂質離子之間CCS值差異更大。Paglia等[38]將TWIMS與兩種傳統脂質鑒定方法(LC-MS和Shotgun-MS)相結合，提高了脂質鑒定的分辨率和可信度。該方法通過測定人大腦中13類共244種脂質的CCS值，發現在以脂質m/z為橫坐標，CCS為縱坐標的坐標體系中，不同類別和亞類的脂質均分布在不同區域，可以實現很好地區分，且同亞類脂質的CCS與其m/z之間也呈線性關系。同時，研究結果也表明脂質的CCS值具有高度可重復性，不受實驗室和儀器的影響(RSD<3%)。

為驗證所測CCS值的準確性，很多研究者利用脂質標準物測得或利用計算機建模計算生成CCS值，建立了脂質CCS標準數據庫[38-39]。Zhou等[40]利用基于機器學習的預測模式對脂質分子的CCS值進行準確預測，并建立了巨大的脂質CCS值數據庫(LipidCCS)。首先采用大量脂質標準品測得的CCS值建立預測模型，同時使用生物信息學手段優化結構分子描述符，使該系統在不同實驗室、不同儀器條件下測得的數據預測的CCS值中位相對誤差在1%以下。LipidCCS數據庫包含有15 646種脂質共63 434個CCS值，并提供了免費的網絡端口，從而為基于IM-MS的大規模脂質組學研究提供了重要的分析手段。利用這些脂質CCS數據庫與實驗測得的CCS進行匹配后評分，可減少假陽性和假陰性的判斷。

2.1.2CV值在FAIMS或DMS儀器中，CV值常被用作脂質分離和判別的指標。如Shvartsburg等[41]在2011年首次將DMS應用于脂質分離，利用CV值對不同種類脂質(磷脂、溶血磷脂、甘油酯、半乳糖脂和鞘脂等)進行了很好的區分。此外，在CV值差異不明顯時，還可以通過改變一些外部條件從而實現更好的脂質分離效果。因此，當一些公司研發的商業DMS(如ABSciex研發的SelexION系列)在常規設置無法實現很好的離子分離效果時，可以通過在載氣中添加揮發性的化學修飾劑(如異丙醇等)，以進一步增大分析離子之間CV值的差異，提高分析離子的選擇性和峰強度[42-44]。2014年，Ekroos等[45]將DMS與Shotgun-MS技術串聯分離鑒定磷脂，選擇正丙醇、2-丙醇、正丁醇、正庚烷和氯仿5種化學修飾劑測試磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油的分離效果。發現在同一質譜條件下，當不使用修飾劑時，只有PC可從這些磷脂中分離。而使用正丙醇或異丙醇作為化學修飾劑時，檢測的分辨率最高。脂質離子自身的質荷比對其CV值也有一定影響，故相同類別不同亞類的脂質也可以根據最優CV值進行分離。一般而言，碳鏈長度越長，最優CV值越大，而雙鍵的存在則會降低脂質的CV值，這與CCS值的變化趨勢一致。此外，由于帶電離子在DMS中會受到垂直運行方向的電場力作用，而不同離子的CV值存在差異，只有特異性的脂質離子才能在最優CV值下通過DMS到達檢測器，因此DMS的背景噪音非常小，信噪比很高，其檢測靈敏度相對更高[46-47]。

2.2 分離鑒定脂質異構體

脂質異構體的分離鑒定是脂質分析中最大的挑戰之一，相同質量數的脂質分子可能屬于不同的脂質種類(如PC32∶2和PS36∶1)，也可能是雙鍵位置不同或酰基鏈位置異構(sn-1和sn-2)或空間結構異構(順反異構體和手性異構體)的同類脂質分子[48]。當這些同分異構體存在于復雜生物樣本中時，在不借助分離手段或者其他前處理的情況下，即使用高分辨質譜也無法對其進行準確分析。LC-MS方法在一定程度上可以用于一些脂質異構體標準品，如酰基鏈位置異構或含雙鍵的順反異構體的分離鑒定，但對于復雜基質樣本中同分異構體的精準判斷卻存在困難，許多同分異構體會共洗脫或產生相似的圖譜。其他方法如低能碰撞誘導解離[49]、有機物離子的電子碰撞激發[50]、臭氧誘導解離[51-52]和PB衍生反應[53]等也能對異構體脂質進行鑒定，但需對質譜進行改造或者采用復雜的樣品前處理過程。IM-MS技術可根據異構體的結構和形狀進行分離，將其與傳統色譜分離手段相結合，提高了分離選擇性，從而為脂質異構體的分離提供了一個新的維度。

2.2.1雙鍵位置及空間異構體脂肪酸是所有脂質的基本組成單元，其鏈上雙鍵位置不同可以形成不同的異構體。DTIMS-MS可以根據單不飽和脂肪酸標準品內部雙鍵“紐結(Kink)”結構的CCS值差異對其異構體進行區分和鑒定[54]。Groessl等[55]于2015年首次證明了使用高分辨DTIMS-MS對雙鍵位置異構體脂質進行分離的可行性，考察了不同離子加合物(H+、Na+、K+)對PC18∶1(6Z)/18∶1(6Z)、PC18∶1(9Z)/18∶1(9Z)以及PC18∶1(9E)/18∶1(9E)CCS值的影響。結果表明Na+加合物的CCS值差異最大，并成功應用于復雜生物樣本(牛心臟、豬腦和酵母)中PC 18∶1(9Z)/18∶1(9Z)的鑒定。Kyle等[54]也發現由于單不飽和脂肪酸中呈順式方向的雙鍵會使主鏈比反式方向更彎曲，從而具有更小的CCS值，據此分離了順反異構體單不飽和脂肪酸。另外，在順式單不飽和脂肪酸中，當雙鍵位置遠離羧基端時，也會使整個脂肪酸鏈更彎曲，導致更小的空間構象。同樣地，在甘油磷脂的異構體鑒定中，Wojcik等[56]發現當PC酰基鏈上的單個雙鍵位置越靠近其頭部基團時，整個PC分子的空間構象也會變大。DMS/FAIMS-MS也在雙鍵位置異構體鑒定中有著重要的應用。Bowman等[57]利用高電場FAIMS-MS成功對甘油酯和甘油磷脂的雙鍵位置異構體進行分離和鑒定。本實驗室使用DMS-Q TOF MS對C17∶1雙鍵順反異構體(C17∶1(10Z)和C17∶1(10E))進行了分離，發現當分離電壓(SV)為3 200 V時，兩種異構體不能分離；當SV為3 900 V時，在CV值為最優(8 V和11 V)時，兩種異構體的分離效果很好。說明在適宜參數下，DMS-MS也可以對雙鍵位置異構體進行準確地判別。

2.2.2sn位置異構體另一類脂質異構體是由于脂肪酸位于脂質骨架分子的不同位置(sn-1、sn-2、sn-3)所致，統稱為位置異構體。Kyle等[54]采用DTIMS對不同脂肪酸位置異構的PC(如PC16∶0/18∶0和 PC18∶0/16∶0)進行分離，發現當較長的酰基鏈連接在sn-1位時，整個PC分子的構象大于連接在sn-2位。但雙鍵的存在會使酰基鏈尺寸減小(如18∶1<16∶0)，所以含雙鍵酰基鏈連接在sn-1時，其分子尺寸會小于該位置為飽和脂肪酸的脂質分子。Groessl等[55]使用Ag+與PC 16∶0/18∶1和PC18∶1/16∶0形成加合物，成功將其在高分辨DTIMS-MS中分離鑒定，并采用該方法在豬腦提取物樣本中發現存在88%的PC 16∶0/18∶1和12%的PC18∶1/16∶0。DMS-MS同樣也在位置異構體鑒定中展現出巨大的潛力。Maccarone等[58]利用DMS-ESI MS在不同CV值下分離了Ag+與PC 16∶0/18∶1和PC18∶1/16∶0的加合物，可對PC的sn位置異構體相對含量進行準確定量，結果與傳統磷脂酶水解法一致，并將其應用于雞蛋黃、牛腎、牛腦中PC異構體的測定。ala等[59]利用類似的方法，以1-丁醇或1-丙醇為化學修飾劑，用DMS成功分離了含不飽和脂肪酰基鏈的甘油三酯位置異構體。與傳統的銀離子法或反相高效液相色譜-串聯質譜法相比，優化的DMS-MS方法可在1 min內實現所有異構體的分離，大大提高了分析通量。利用該方法測定了豬脂肪組織提取物中OSO/SOO、SOS/SSO、POP/OPP和OPO/OOP 4對不同甘油三酯位置異構體的相對含量，結果與傳統方法一致。

2.2.3手性異構體脂質分子內部手性中心的判斷，即手性異構體脂質的分離鑒定屬于脂質異構體鑒定中的難題。研究報道[60]，將手性助劑(如2-丁醇的對映異構體)摻入DTIMS-MS裝置漂移氣體中時，一些氨基酸、葡萄糖等的手性異構體可以實現一定的分離。2013年，Ahonen等[61]對激素類固醇手性異構體(α-雌二醇/β-雌二醇、3α-雄酮/3β-雄酮和17α-睪酮/17β-睪酮)進行衍生化處理后，用TWIMS-MS對其進行了分離。由于原始的固醇異構體之間的CCS值非常接近，很難直接分離，而與對甲磺酰基異氰酸酯衍生化反應后，異構體間的CCS值差異增大，且離子與漂移氣體間相互作用的強度增加，從而改善了其在IMS中的分離效果。Kyle等[54]使用DTIMS-MS在正離子模式下對神經酰胺手性異構體Cer(d18∶1/18∶0(2S-OH) )和Cer(d18∶1/18∶0(2R-OH))的鈉加合物進行分離。當鈉離子結合到R構型的Cer時，2-OH基團會遠離長酰基鏈，使兩條酰基鏈緊密且結構緊湊；而在S構型的Cer中2-OH基團會靠近長酰基鏈，從而導致兩條酰基鏈互相之間排斥，形成更大的結構。這兩種不同結構會使二者CCS的差異增大，從而實現兩種手性異構體的分離。

3 總結與展望

IMS作為一種分離手段，已被越來越多地應用于脂質組學研究中，尤其是隨著一些數據處理軟件的開發，能夠實現對IM-MS提供的關于脂質離子信息的自動處理，從而為大規模脂質組學研究帶來了新的契機。將IMS與傳統基于MS的脂質分析方法相結合，首先為脂質鑒定提供了更多關于分子結構和構象方面的信息(CCS值、DT值、CV值)，有效地提高了脂質，尤其是異構體脂質的分離效果，同時排除了假陽性和假陰性干擾；其次，減少了背景噪音的干擾，提高了信噪比，使脂質離子的譜圖更加清晰，為解譜工作帶來了很大便利；最后，相對于傳統分離手段，IMS可在ms時間內實現離子的分離，可與MS技術實現完美結合，且不影響樣品分析時間，從而提高樣品的分析通量。

近年來，各種分析儀器的快速發展以及新分析方法的不斷開發和涌現為脂質組學的研究提供了新的發展方向。使用單獨的某一種技術很難實現復雜生物樣本中所有脂質的分離和鑒定，未來的脂質組學研究一定是基于各種技術和儀器的聯用。新的快速分離分析手段也將日益得到研究者的重視，IM-MS技術就是這一背景下的產物，相信這一技術在未來的脂質組學研究中將扮演更加重要的角色。