紅棗中4種鏈格孢菌毒素的檢測及風險評估

程家興，黎明陽，楊雨希，楊 茜，袁 滌，楊 頡，王毅聰，張銳利，杜振霞*

(1.北京化工大學 理學院，北京 100029；2.塔里木大學 生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

紅棗是中國新疆產量較大的瓜果之一，具有較高的營養和保健價值。真菌毒素污染是現階段影響紅棗產業健康發展的重大隱患，相關菌株侵染造成的新疆紅棗“黑斑病”爆發越來越頻繁，導致近幾年紅棗產量平均損失達30%以上(極端天氣達60%)，和田地區棗園發病率更是高達50%以上[1]，造成了巨大經濟損失。有研究報道紅棗黑斑病致病菌主要為鏈格孢菌[2]，而鏈格孢菌鏈格孢菌毒素對人體有較大危害[3]，會引發細胞DNA突變，提高癌癥發病率[4]。鏈格孢菌較為重要的代謝物有二苯并吡喃酮衍生物——鏈格孢酚(Alternariol，AOH) 、交鏈格孢酚單甲醚(Alternariol monomethyl ether，AME)、細交鏈格孢菌酮酸(Tenuazonic acid，TEA)及騰毒素(Tentoxin，TEN)，而TEN是僅有的一種多肽類代謝產物，且毒性較強[5-6]。鏈格孢菌種可在低溫下生長，在紅棗的生長、采摘、儲運及加工過程中也有產生鏈格孢菌毒素的風險。因此，針對新疆紅棗中鏈格孢菌毒素的檢測及風險評估具有重要的理論意義和應用價值。

Arcella等[7]使用毒理學關注閾值(TTC)方法評估了這些毒素對人體健康的影響。2011年，歐洲食品安全局(EFSA)針對飼料和食品中鏈格孢菌產生的毒素導致的公共衛生風險提出了科學意見[8]。目前，除巴伐利亞健康和食品安全權威機構外，世界各地均無關于霉菌毒素的法規[9]。Wei等[10]對中國干果中的鏈格孢菌毒素與其他毒素進行調查，發現在31.4%的干果中同時存在2～4種真菌毒素。故對鏈格孢菌的定性定量分析意義重大。目前關于紅棗中鏈格孢菌毒素的定性定量研究較少，因此亟需建立紅棗中該毒素的快速檢測方法。

目前文獻報道的檢測鏈格孢毒素的方法有液相色譜(LC)法及液相色譜-質譜聯用(LC-MS)法[11]、薄層色譜(TLC)法[12]、氣相色譜(GC)及氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)法[13]、酶聯免疫吸附法(ELISA)法[14]。本研究建立了超高效液相色譜-串聯質譜技術檢測紅棗中鏈格孢菌毒素的方法，借鑒QuEChERS前處理方法，在保證較高回收率的情況下，簡化了前處理的步驟，相比已有方法具有檢出限低、檢測時間短等優勢。本方法樣品前處理簡單，回收率高，基質效應低，提高了TEA、AOH在質譜中的靈敏度，具有靈敏度高、重現性好等優點，可滿足大棗中4種鏈格孢菌毒素的檢測要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Quatrro-Premier XE超高效液相色譜-串聯質譜儀(美國Waters公司)，配有ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；KH-100DE型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；WH-861渦旋混合器(太倉市華利達實驗設備有限公司)；Anke TGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；Milli-Q A10超純水器(美國Millipore公司)；0.22 μm有機濾膜(津騰公司)。

交鏈格孢酚單甲醚(AME)、鏈格孢酚(AOH)、騰毒素(TEN)、細交鏈格孢菌酮酸(TEA)標準品(純度>98%，新加坡Pribolab公司)。乙腈(色譜純，Fisher Chemical公司)；甲酸(純度>98%，Acros公司)；氯化鈉(分析純，Aladdin公司)。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液：準確稱取1.00 mg 4種毒素標準樣品溶于1 mL 2.0%甲酸-乙腈溶液中，配制成質量濃度為1.0 g/L標準貯備液，-20 ℃保存。

標準工作液：使用2.0%甲酸-乙腈溶液配制質量濃度分別為1、2、5、10、50、100、500、1 000、2 000、5 000 μg/L的TEA、AME、TEN和AOH混合標準溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱量0.2 g(精確至0.01 g)紅棗樣品于10 mL離心管中，加入5 mL 2.0%甲酸-乙腈溶液，20 ℃下恒溫超聲提取30 min，加入0.2 g NaCl固體粉末，渦旋30 s后以8 000 r/min離心10 min，用注射器取上清液，過0.22 μm有機濾膜后上機檢測。

1.4 色譜-質譜條件

超高效液相色譜條件：流動相：A為超純水,B為乙腈。洗脫梯度：0～3.0 min，95%～60%A;3.0～4.3 min，60%～5%A;4.3～5.0 min，5%A；5.0～5.1 min,5%～95%A;5.1～6.0 min,95%A;流速：0.35 mL/min，色譜柱:Acquity UPLC BEH C18液相色譜柱( 50 mm ×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：35 ℃，進樣量：2 μL。

質譜條件：離子化模式：電噴霧離子源(ESI-)；掃描方式：多反應監測(MRM)；毛細管電壓2.5 kV,離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度 350 ℃，脫溶劑氣流量 650 L/h，錐孔反吹氣流量 50 L/h，碰撞氣流量 0.15 L/min。4種鏈格孢霉毒素的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞電壓等質譜參數如表1所示。

表1 4種鏈格孢霉毒素的串聯質譜測定參數Table 1 MS/MS parameters of fouralternaria mycotoxins

*quantitation ion

2 結果與討論

2.1 色譜-質譜條件的選擇

在ESI-電離模式下，以[M-H]-的準分子離子峰作為母離子，得到TEN、TEA、AOH、AME的母離子分別為m/z413.3、196.1、257.1、271.1。再進行子離子掃描，確定MS/MS中兩個子離子豐度較高時的碰撞電壓，并確定各目標化合物的定性和定量離子對。

實驗發現在配制標準品溶液時加入甲酸可顯著提高TEA和AOH的質譜響應。分別比較了使用0.1%甲酸-初始流動相、0.5%甲酸-初始流動相、1.0%甲酸-初始流動相、1.5%甲酸-初始流動相、2.0%甲酸-初始流動相和2.5%甲酸-初始流動相配制毒素標準品時的質譜響應，結果表明用2.0%甲酸-初始流動相配制的毒素標準品溶液的響應最高。

選用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱進行色譜條件優化。考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5 mmol乙酸銨水溶液和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液多種流動相的分離效果，結果表明在流動相中加入甲酸或乙酸銨均會抑制毒素在質譜中的響應，最終確定以乙腈-水作為流動相，優化并確立了梯度洗脫程序。

圖1 4種鏈格孢菌毒素的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of fouralternaria mycotoxins

在優化色譜條件下，難分離的AOH和TEN得到更好的分離[15]，TEA和AOH的靈敏度也進一步提高，圖1為4種毒素混合標準溶液的總離子流圖。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1樣品量的影響文獻[16-17]一般采用2.0～5.0 g樣品進行鏈格孢菌毒素提取，通過前期實驗發現，實際被鏈格孢菌感染的紅棗中4種毒素的含量很高，尤其是TEA在樣品量高于0.5 g時即超出線性范圍，易造成色譜柱過載。本實驗分別考察了0.1、0.2、0.5 g樣品量對紅棗鏈格孢菌毒素回收率的影響。結果表明，當樣品量為0.1、0.2 g時的回收率相近，4種毒素的回收率均在90%以上，但0.1 g樣品量下部分毒素的精密度和重現性差，AOH和TEA的相對標準偏差(RSD)為10.1%～21.3%。樣品量為0.5 g時，TEA的平均回收率降至75.4%，因此選擇0.2 g為樣品的稱取量。

2.2.2提取溶劑的影響4種毒素極性均較大，因此本實驗分別選用極性較大的有機溶劑(即含2.0%甲酸的甲醇和含2.0%甲酸的乙腈)對紅棗中的鏈格孢菌毒素進行提取。結果發現，以含2.0%甲酸的甲醇作為提取溶劑時,溶液顏色變深，表明基質效應明顯，且4種毒素的回收率均下降，其中TEA的回收率由103%降至62.4%。因此，本實驗選擇2.0%甲酸-乙腈作為提取溶劑。

2.2.3干燥劑的影響本實驗的前處理方法借鑒QuEChERS方法，簡化了其吸附劑的步驟，比較了使用無水MgSO4干燥和不使用干燥劑兩種情況下4種毒素的回收率。由于紅棗本身水分較少，因此兩種情況下4種毒素的回收率相差不大，均在90%以上。在不引入其他雜質的情況下，選擇不使用干燥劑。

2.3 基質效應的影響

分別用溶劑標準溶液和基質空白標準溶液配制500 μg/L的4種毒素混合溶液。通過下式計算基質效應(ME)：ME=(S1-S2)/S2，式中S1為毒素標準品在基質空白標準溶液中的平均峰面積，S2為毒素標準品在純溶劑標準溶液中的平均峰面積。

結果表明，AME的ME為-4.65%，AOH的ME為-12.44%，TEN的ME為-1.56%，TEA的ME為-25.35%，在基質空白標準溶液中未檢測到強烈的離子抑制(ME<-30%)。表明外標法可用于4種鏈格孢菌毒素的測定。

2.4 方法學評價

2.4.1線性范圍與檢出限在優化條件下，對一系列質量濃度的混合標準溶液進行檢測。以質量濃度為橫坐標，定量離子對的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表2。由表2可見，AOH的線性范圍為1.0～100 μg/L，AME、TEA和TEN的線性范圍為10～1 000 μg/L，在此范圍內線性關系良好(r2>0.990)。當信噪比S/N≥3時，TEN、AME、AOH和TEA的檢出限( LOD )為0.5～12.4 μg/kg。

表2 紅棗基質中4種鏈格孢菌毒素的線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限(LODs)Table 2 Liner ranges，linear equations，correlation coefficients and limits of detection(LODs) of four alternaria mycotoxins in jujube

2.4.2回收率與相對標準偏差按優化條件，在空白樣品基質中進行3個水平(40、100、400 μg/kg)的加標回收實驗，每個加標水平平行實驗3次，測定4種鏈格孢菌毒素的加標回收率及相對標準偏差(RSD)。結果顯示，4種鏈格孢菌毒素的平均回收率為92.8%～116%，RSD為0.5%～11.2%，日間精密度為2.1%～12.3%，表明方法具有良好的準確度與精密度。

2.5 實際樣品的測定

采用本方法檢測10份新疆紅棗實際樣品，其中4份檢出鏈格孢菌毒素，AOH、AME、TEN和TEA的檢出量分別為0.048～5.050 mg/kg、LOD～11.770 mg/kg、LOD～0.320 mg/kg、1.205～1 070.300 mg/kg;其中TEA在紅棗中檢出量最高，與文獻報道一致[17-18]。

2.6 風險評估

目前，全世界有80多個國家和地區制定了果品中真菌毒素的限量標準，但均未包括鏈格孢菌毒素[6]。鏈格孢菌毒素廣泛分布于果蔬食品中，其檢出率為25%～75%[19]。本研究在紅棗中檢出的最高含量達1 070.300 mg/kg，遠高于鏈格孢菌毒素在其他食品中的含量。高檢出率與高含量可能會存在潛在的健康隱患，因此本實驗基于T.E.S.T軟件和Toxtree軟件計算了4種鏈格孢菌毒素的毒理學評估數據(表3)。表3中TTC Class、Protein binding Alerts 和DNA binding Alerts由Toxtree軟件給出，生物蓄集系數(Bioaccumulation factor)和LD50由T.E.S.T軟件給出。LD50(man)根據LD50值使用等效劑量系數轉換的方法計算得到[20]。最大無效水平(The maximal no-effect level，NOEL)根據公式(1)得到，在此基礎上根據公式(2)得到允許每日暴露量(The permitted dailyexposure，PDE)[21-22]。

(1)

(2)

式中，BW表示成年人的體重，F1～F5均為不確定因子，在本研究中的取值依次為12、10、10、10、1。由表3可知，體重為60 kg的成年人的PDE范圍為19.30～25.65 μg/d，而TEA在紅棗中的最高含量高達1 070.300 mg/kg，雖然目前尚無中國人的飲食數據，但果品中鏈格孢菌毒素尤其是檢測含量最高的TEA確實存在健康隱患。同時，相對于TEA，雖然AOH和AME的含量較低，但AOH和AME具有遺傳毒性，其潛在危害亦不可忽視。

表3 4種鏈格孢菌毒素的毒理學評估Table 3 Toxicological assessment of four alternaria mycotoxins

3 結 論

本文利用超高效液相色譜-串聯質譜法并結合簡化的QuEChERS技術，建立了快速檢測紅棗中TEA、AOH、TEN和AME 4種鏈格孢菌毒素的方法。該方法樣品前處理簡單，回收率均大于90%，基質效應小，具有操作簡便、快速、靈敏度高、檢出限低、重現性好等優點，能滿足紅棗中鏈格孢菌毒素的檢測要求。同時運用毒理學軟件對4種鏈格孢菌毒素進行毒理學評估，發現鏈格孢菌毒素對于人體具有潛在危害，值得關注。未來可擴大范圍測定其他果蔬中鏈格孢菌毒素含量，并結合中國人飲食數據，從而更加準確評估中國人鏈格孢菌毒素的日暴露量。