超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測柑橘樣品中氟吡呋喃酮及其代謝物殘留

李雙雙，歐曉明,*，金晨鐘*，晏 姣，張貴群，梁 驥，梁貴平

(1.湖南人文科技學院 農藥無害化應用重點實驗室/湖南省農田雜草防控技術與應用協同創新中心，湖南 婁底 417000；2.湖南化工研究院 國家農藥創制工程技術研究中心，湖南 長沙 410014；3.湖南加法檢測有限公司，湖南 長沙 410014)

氟吡呋喃酮(Flupyradifurone)，商品名為Sivanto或Sivanto Prime，化學名為4-[(6-氯-3-吡啶基甲基)(2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮，是德國拜耳公司開發的一種新型丁烯酸內酯類殺蟲劑，可作用于靶標害蟲的中樞神經系統，為昆蟲煙堿乙酰膽堿受體激動劑，主要登記用于防治蔬菜、果樹、棉花、大豆等作物的蚜蟲、粉虱、木虱、葉蟬等害蟲，表現出明顯的內吸、觸殺、胃毒、滲透和選擇作用，且對蜜蜂安全[1-2]，其代謝物為二氟乙酸(DFA)、二氟乙氨基呋喃酮(DFEAF)和6-氯煙酸(6-CNA)。目前針對氟吡呋喃酮的研究主要集中于合成和應用方面，如楊吉春[3]、曹慶亮[4]、趙國建[5]等研究了氟吡呋喃酮的合成，陳敏[6]、胡菡青[7]等進行了氟吡呋喃酮對番茄煙粉虱和柑橘木虱的田間藥效試驗，武鵬等[8]報道了氟吡呋喃酮的原藥分析方法，而有關氟吡呋喃酮及其代謝物在柑橘上的殘留分析方法及其在環境中的歸趨研究尚未見報道[9-12]。基于此，本文采用超高效液相色譜-三重四極桿質譜技術(UPLC-MS/MS)建立了同時檢測柑橘樣品中氟吡呋喃酮及其代謝物殘留的方法，以期為該藥劑在柑橘生態系統中的合理安全用藥及其環境安全評價提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1290-646型超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀(美國安捷倫公司)，AL204型電子天平(瑞士梅特勒·托利多儀器有限公司)，Scout SE型百分之一電子天平(奧豪斯公司)，HY-B1 型回旋振蕩器(金壇市醫療儀器廠)，Vortex-5型渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，Zonkia SC-3614型低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

乙腈(質譜純，Honeywell公司)，甲酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，氯化鈉(分析純，西隴化工公司)，PSA填料(北京安捷飛科技有限公司)；標準品：氟吡呋喃酮(純度99.4%)、二氟乙酸(DFA，純度95.5%)、二氟乙氨基呋喃酮(DFEAF，純度99.3%)、6-氯煙酸(6-CNA，純度98.9%)均由湖南化工研究院國家農藥創制工程技術研究中心提供。實驗用水為超純水(自制)。

1.2 樣品分析方法

1.2.1提取與凈化準確稱取適量柑橘樣品(柑橘皮10 g、柑橘全果20 g)于150 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL乙腈，回旋振蕩1 h，靜置取上清液2 mL，加200 mg PSA，渦旋20 s，離心5 min，取上清液過0.22 μm有機相濾膜至進樣瓶中，待測。

稱取柑橘橘肉20 g于150 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL乙腈，回旋振蕩1 h，提取液轉移至100 mL具塞量筒中，加入5 g NaCl，劇烈搖動，靜置10 min，上清液過0.22 μm有機相濾膜至進樣瓶中，待測。

1.2.2分析條件色譜條件：Thermo Hypercarb色譜柱(100 mm×3 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液(70∶30，體積比)，等度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μL。

質譜條件：多反應監測模式(MRM)，正負離子掃描(ESI)，離子噴霧電壓3 500 V，霧化氣壓力103.4 kPa，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速7 L/min。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的確定

取1 mg/L的氟吡呋喃酮及代謝物混合標準溶液，用針泵進樣的方式，首先進行全掃描(Q1scan)，確定各成分的母離子，其次通過MS2SIM確定錐孔電壓(DP)，再用Product Ion功能找出子離子并確定碰撞能量(CE)，最后用MRM 掃描的方式優化各質譜參數。

氟吡呋喃酮及其3個代謝產物均含氨基或羰基，易形成穩定的[M+H]+的準分子離子，配制 1 mg/L 的標準溶液，使用兩通連接液相色譜與質譜，在正離子模式下全掃描得到氟吡呋喃酮母離子(m/z288.8)和DFEAF母離子(m/z164.0)；在負離子模式下全掃描得到6-CNA母離子(m/z156.0)和DFA母離子(m/z95.1)。將分子離子作為母離子，給予一定的碰撞能量和碰撞氣體，全掃描二級離子，選取豐度較強、干擾較小的 2 個子離子分別作為定性及定量離子(見表1)。

2.2 碎裂電壓與碰撞能量的優化

以氟吡呋喃酮為例對碎裂電壓進行優化。將氟吡呋喃酮配成1 mg/L的標準溶液，以10 μL進樣。初步考察了碎裂電壓為200、150、100、50、20 V時的響應值，結果顯示150～200 V之間的響應值較高；再考察了碎裂電壓為200、180、160、140、120 V時的響應值，結果顯示160 V出現最大響應值；最后將電壓設定為175、170、165、160、155、150 V，結果顯示電壓為165 V時響應值最大。實驗選擇氟吡呋喃酮、DFEAF、6-CNA、DFA的最優碎裂電壓分別為165、100、50、35 V。

在最優電壓條件下，以氟吡呋喃酮為例對碰撞能量進行優化。將氟吡呋喃酮配成1 mg/L的標準溶液，進樣10 μL。先將碰撞能量設置為50、40、30、20、10、5 V，結果顯示子離子m/z288.8/125.8在20 V時出現最大響應值，m/z288.8/89.9在30 V時出現最大響應值；再細分各子離子的碰撞能量，發現子離子m/z288.8/125.8在22 V時出現最大響應值，m/z288.8/89.9在34 V時出現最大響應值。氟吡呋喃酮及其代謝物優化后的碎裂電壓和碰撞能量等質譜參數見表1。

表1 氟吡呋喃酮及其代謝物的質譜檢測參數Table 1 MS/MS conditions of flupyradifurone and its metabolites

2.3 流動相的優化

實驗對比了甲醇-水和乙腈-水作為流動相時的質譜響應，發現乙腈-水為流動相時氟吡呋喃酮及其3個代謝產物的質譜響應更好，因此采用乙腈作為流動相中的有機相。另外，考察了在水相中分別添加 0.1%甲酸、1.0 mol/L 乙酸銨和 0.1%甲酸- 1.0 mol/L 乙酸銨對色譜分離及靈敏度的影響，結果顯示3 種添加劑對目標分析物的色譜峰形及分離的影響差別不大，但添加少量甲酸后，各化合物的離子化效率更高，靈敏度更好，且添加甲酸的效果好于添加乙酸銨。基于此，本實驗最終采用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

2.4 吸附劑的優化

分別考察了不同質量的PSA對凈化效果和回收率的影響，結果發現 PSA用量為50、100、200、400 mg時，氟吡呋喃酮及其代謝物的回收率分別為52%～69%、67%～86%、89%～100%、70%～84%。本實驗最終選用200 mg PSA作為吸附劑。

2.5 基質效應的考察

基質效應(Matrix effects，ME)是指基質中的共提取干擾物質影響目標化合物的離子化，從而使目標化合物在儀器上的響應發生增強或抑制的現象[13]。因此在進行農殘測定時，對目標化合物在不同基質中的基質效應進行評價尤為重要。本文采用較為常用的相對響應值法評價基質效應：ME=(B/A-1)×100%，其中A 為純溶劑中化合物的響應值，B 為柑橘基質中添加相同濃度農藥的響應值[14]。實驗考察了0.05、0.1、0.5 mg/L 3個加標水平下4種化合物在全果、果肉、果皮3種柑橘基質中的基質效應。結果表明，在上述3個水平下的基質效應分別為-16.65%～9.68%、18.76%～8.29%和-15.91%～10.59%，基質效應均小于20%，屬于弱基效應，對結果影響較小。

2.6 線性關系與定量下限

將500 mg/L的氟吡呋喃酮及其代謝物混合標準溶液用乙腈稀釋配成1、5、10、50、100、500 μg/L的系列混合標準工作溶液，按“1.2.2”的色譜條件進行測定。以監測離子峰面積(y) 對相應質量濃度(x，μg/L) 作標準曲線，得到氟吡呋喃酮及其代謝物的線性方程。結果表明，在1～500 μg/L范圍內，氟吡呋喃酮及其代謝物的峰面積與質量濃度呈良好的線性關系，相關系數(r2)為0.997 9～0.999 6。

定量下限(LOQ)采用加標回收率進行驗證，以符合一定的準確度和精密度要求的最低加標濃度確定為定量下限。經驗證，該方法的檢出限(LOD，S/N=3)為0.001 mg/L，氟吡呋喃酮及其代謝物在柑橘全果、橘肉中的LOQ為0.05 mg/kg，橘皮中的LOQ為0.1 mg/kg。與其他方法[9-11]相比，本方法的分析時間更短，檢出限低于或接近已有方法，靈敏度較高。

2.7 加標回收率與相對標準偏差

采用基質匹配標準溶液外標法定量，在空白柑橘基質中對氟吡呋喃酮及其代謝物進行3個濃度水平的加標回收實驗，每個水平處理5個重復，按“1.2.2”的方法進行測定，計算回收率和相對標準偏差(RSD)，結果見表2。由表2可見，氟吡呋喃酮及其代謝物在柑橘全果、果肉中的回收率為71.9%～106%，RSD為0.8%～9.1%；柑橘果皮中的回收率為77.9%～100%，RSD為1.2%～6.5%，說明該方法的精密度和準確度均符合農藥殘留分析的基本要求[15]。

表2 氟吡呋喃酮及其代謝物在柑橘樣品中添加回收率Table 2 The recovery of flupyradifurone and its metabolites in citrus samples

2.8 實際樣品的分析

根據《農藥殘留試驗準則》[15]和《農藥登記殘留田間試驗標準操作規程》[16]進行了17%氟吡呋喃酮溶液在柑橘作物上的最終殘留田間試驗，有效成分用量分別為低劑量制劑2 000倍液(有效成分100 mg/kg)和高劑量制劑1 333倍液(有效成分150 mg/kg)，各設3次施藥和4次施藥兩個處理，另設清水空白對照，處理間設保護帶，施藥間隔期為10 d，每個處理重復3次，末次施藥后間隔14、21、28 d采集柑橘樣品，按照“1.2.2”方法測定氟吡呋喃酮及其代謝物在柑橘中的最終殘留量，結果見表3。由表3可見，氟吡呋喃酮相較于其代謝產物的檢出率更高，且以在柑橘果皮中的檢出濃度較高。

表3 氟吡呋喃酮及其代謝物在實際柑橘樣品中的殘留量Table 3 Detection data of flupyradifurone and its metabolites in citrus field samples

(續表3)

CompoundEffective dose(mg/kg)Times of applicationResidual quantity(mg/kg)Citrus fruitCitrus pulpCitrus peel4<0.05<0.05<0.11503<0.05<0.05<0.14<0.05<0.05<0.1DFA1003<0.05<0.05<0.14<0.05<0.05<0.11503<0.05^0.051 8<0.05<0.1^0.1224<0.05<0.05<0.1^0.116

3 結 論

本文采用UPLC-MS/MS技術建立了同時檢測柑橘全果、果肉、果皮中氟吡呋喃酮及其代謝物殘留量的定性定量分析方法。樣品以乙腈提取，經分散固相萃取凈化，直接上機分析，較常用的液相色譜法縮短了樣品前處理的時間。該方法選擇性強、重現性好、靈敏度高，且前處理簡單，溶劑用量少，適用于柑橘樣品中氟吡呋喃酮及其代謝物的快速檢測，并成功應用于實際樣品的測定。