中藥與慶大霉素聯合對16S rRNA甲基化酶耐藥重組菌的作用研究

陳 琳， 管遠紅， 黃東璋， 齊富剛， 張洪濤， 陳冬冬， 區卓麟， 于淼淼，吳懷秀， 楊雨秋， 陳瀛川， 王亞南， 蘇哲君， 張 歡

(江蘇農牧科技職業學院動物醫學院，江蘇泰州 225300)

當前，耐藥性是臨床抗感染治療面臨的嚴重挑戰，抗耐藥菌感染已成為全球性臨床醫學重大難題[1-5]。研究表明，中藥對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐藥鮑曼不動桿菌、產超廣譜β-內酰胺酶耐藥菌均有一定的影響和作用[6-10]。雖然從抗菌效價或抗菌作用強度比較，幾乎所有中藥的抗菌作用均弱于抗生素[11]，但是由于中藥不但可以作用于細菌繁殖的不同階段及多個代謝環節，中藥和西藥聯用還可以相得益彰，為臨床用藥提供更多的選擇[12]，同時，中藥能夠從整體上提高機體的免疫功能，減輕感染引起的病理損害，起到非特異性治療的作用[5]。如熊南燕等報道，體內外無抗菌活性的魚腥草注射液，對兔體內硫酸慶大霉素注射液抗菌活性有明顯增強作用[13]。

筆者所在課題組前期研究中發現，中藥黃連、黃芩、五倍子、連翹等對16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌有一定的抑制作用，而氨基糖苷類抗生素是治療革蘭氏陰性菌感染的重要藥物，由于16S rRNA甲基化酶的出現，導致慶大霉素、阿米卡星等氨基糖苷類抗生素在臨床抗革蘭氏陰性感染中喪失其作用。因此，本研究擬以構建的16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌為研究對象，研究黃連、五倍子、黃芩等幾種中藥免煎顆粒聯合慶大霉素對16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的作用，一方面為臨床用藥提供依據，另一方面，為16S rRNA甲基化酶耐藥菌感染提供更多的治療用藥選擇。

1 材料與方法

1.1 菌株

16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌pRmtB1。質控菌E.coliATCC 25922，購自衛生部藥品生物制品檢定所。

1.2 培養基

水解酪蛋白肉湯(MH Broth)，水解酪蛋白瓊脂(MH agar)，購自杭州天和微生物試劑有限公司。紅四氮唑，購自揚州科能生物技術有限公司。

1.3 供試藥物

黃連顆粒(批號1501140，生藥含量3 g)、醋五味子顆粒(批號1502099，生藥含量6 g)、連翹顆粒(批號1411052，生藥含量10 g)、烏梅顆粒(批號1412062，生藥含量10 g)、黃芩炭顆粒(批號1303143，生藥含量10 g)、五倍子顆粒(批號1408125，上藥含量3 g)，均購自江陰某藥業有限公司。硫酸慶大霉素(批號0304，含量590 μg/mg)。

1.4 受試藥液的制備及稀釋

稱取受試中藥顆粒，分別用滅菌超純水溶解成如表1所示的藥物濃度，針頭濾器過濾后分裝，于-20 ℃或-70 ℃冷凍保存備用。

表1 藥物貯備液配制濃度

1.5 菌液制備

在MH瓊脂平板上挑取pRmtB1單個菌落接種于2～5 mL Muller-Hinton(MH)肉湯管中，37 ℃振蕩培養4～8 h，用調節過鈣鎂離子的MH肉湯稀釋菌液，使稀釋菌液達到 0.5 麥氏比濁管濁度，再按1 ∶100稀釋菌液至含菌量約為 1×106CFU/mL，備用。

1.6 聯合用藥測定方法

采用棋盤微量稀釋法(Checkerboard Microdilution)[14-16]測定2種藥的部分抑菌濃度指數(frictional inhibitory concentration index，FICI)。具體操作如下：首先，應用微量稀釋法測定2種藥物的MIC，作為棋盤稀釋法的中心濃度。然后分別以2種藥MIC的2、4、8、16倍及1/2、1/4、1/8倍稀釋藥物。取出無菌的96孔微量細胞培養板，置于超凈工作臺，向96孔微量細胞培養板的前8行及前8列各孔中加入肉湯稀釋好的菌液(1×106CFU/mL )100 μL。然后分別沿縱軸加入不同濃度的甲藥50 μL，沿橫軸加入不同濃度的B藥 50 μL，A藥單沿橫軸1～7孔分別加入2倍稀釋的A藥 100 μL，B藥單沿縱軸1～7孔分別加入2倍稀釋的B藥 100 μL，第9列肉湯組只加入肉湯200 μL，第10列菌液組只加入菌液200 μL。加樣完畢后，將細胞培養板置于 37 ℃ 培養16～18 h。觀察結果前2 h，于細胞培養板的每孔均加入0.5%的紅四氮唑溶液5 μL，37 ℃繼續培養2 h，分別觀察記錄2種藥單獨作用的最低抑菌濃度(MICA及MICB)及聯合作用的最低抑菌濃度(MICAB及MICBA)。當第10列菌液對照組的細菌明顯生長，呈現紅色，第9列肉湯對照組無細菌生長，呈現無色，各試驗組小孔內能完全抑制細菌生長的最低藥物濃度即為MIC值(即第1個顏色不變的小孔所對應藥物濃度即為MIC)。如出現單一跳孔，則記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度，如出現多孔跳孔的現象，則必須重新試驗。

1.7 聯合用藥判定標準

按照下列公式計算部分抑菌濃度指數(FICI)，按照表2的判定標準對2種藥物的聯合作用效果進行評價。

式中：MICA為A藥單用時測得的MIC；MICAB為A、B 2種藥聯用時測得的A藥MIC；MICB為B藥單用時測得的MIC；MICBA為A、B 2種藥聯用時測得的B藥MIC。

表2 聯合用藥效果評價判定標準

2 結果與分析

2.1 黃連免煎顆粒與硫酸慶大霉素聯合作用結果

表3 黃連與硫酸慶大霉素聯合對16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的作用結果

2.2 五倍子免煎顆粒與硫酸慶大霉素聯合作用結果

2.3 連翹免煎顆粒與硫酸慶大霉素聯合作用結果

表4 五倍子與硫酸慶大霉素聯合對16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的作用結果

表5 連翹與硫酸慶大霉素聯合對16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的作用結果

2.4 黃芩免煎顆粒與硫酸慶大霉素聯合作用結果

表6 黃芩與硫酸慶大霉素聯合對16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的作用結果

2.5 烏梅免煎顆粒與硫酸慶大霉素聯合作用結果

表7 烏梅與硫酸慶大霉素聯合對16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的作用結果

3 討論

聯合用藥是增強藥物療效、延緩或減少耐藥性產生的一種重要手段和方法。王耘等研究表明，貝母的有效成分貝母素乙聯合氨芐西林舒巴坦可逆轉細菌對氨芐西林舒巴坦的耐藥性，三藥聯合的體內抗菌作用增強。何明等研究雙黃連、清開靈與頭孢哌酮聯合對產超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌所致敗血癥動物模型的協同抗菌作用發現，雙黃連、清開靈與頭孢哌酮聯合有協同抗菌作用，不但可提高抗生素對耐藥菌的療效，而且能降低抗生素的使用劑量[17-18]。傅瑞春聯合應用Kirby紙片擴散法、棋盤稀釋法及殺菌曲線法評價大黃素、大黃酸、隱丹參酮等中藥有效成分與青霉素、氨芐西林、阿米卡星等多種藥物聯合對耐藥菌的作用，結果顯示中藥與西藥聯合后，有的呈現協同作用，有的呈現無關作用，有的呈現相加作用[16]。本研究中，慶大霉素與五倍子聯合對耐藥重組菌具有協同作用，兩者的聯合抑菌濃度比單獨使用均有所降低，表明五倍子能降低慶大霉素的耐藥水平。另外，黃連、烏梅與慶大霉素聯合后抑菌效應也有一定的增強，但不如五倍子與慶大霉素的聯合效應明顯，而黃芩與慶大霉素聯合后呈現無關作用。

4 結論

中藥五倍子與慶大霉素聯合有協同作用，黃連、烏梅與慶大霉素聯合有相加作用，連翹與黃芩與慶大霉素聯合呈現無關作用。中藥五倍子有望成為慶大霉素抗耐藥菌感染協同劑。