上海地區草莓灰霉病病菌種群抗藥性研究

肖 婷， 成 瑋， 顏偉中， 王建華， 許 媛， 吉沐祥， 楊敬輝

(1.江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇句容 212400； 2.上海市農技推廣中心，上海 200000)

上海市草莓產業發展始于20世紀80年代，近年來，隨著產業的發展，草莓種植面積約為2 000 hm2。隨著品種不斷優化、栽培水平持續提高，草莓供應從11月持續到翌年5月，周期長、效益高，是農民增收的重要途徑之一，草莓產業已經成為種植業結構調整的主要內容。上海地區草莓種植均以塑料大棚種植為主，且長期連作。在每年草莓開花后，大棚均須要蓋外層塑料棚膜，這種封閉的生長條件極利于病害的暴發流行，其中由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的草莓灰霉病是設施大棚草莓開花結果期的主要病害。這是一種世界性病害，廣泛侵染各種蔬果[1]，現階段，生產上防治灰霉病的主要藥劑種類有苯并咪唑類、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑、琥珀酸脫氫酶抑制劑類、苯胺基嘧啶類等藥劑[2-3]，但這些殺菌劑如多菌靈(carbendazim，簡稱Car)、嘧菌酯(azoxystrobin，簡稱Azo)、吡唑醚菌酯(pyraclostrobin，簡稱Pyr)、啶酰菌胺(boscalid，簡稱Bos)、嘧霉胺(pyrimethanil，簡稱Pyr)、嘧菌環胺(cyprodinil，簡稱Cyp)等都是單一作用位點殺菌劑，如果長期、多頻次使用，抗藥性會快速發展。關于灰霉病病菌抗藥性方面的報道，在國內外屢見不鮮[4-10]。

鑒于上海地區目前尚無系統性研究灰霉病病菌種群對常用殺菌劑的抗藥性，本研究連續2年系統檢測上海地區主要草莓種植地區灰霉病病菌種群對9種常用殺菌劑的抗藥性水平，以期探明上海市不同草莓種植地區灰霉病病菌種群的多藥劑優勢亞種群，因地制宜地提出抗藥性治理策略。

1 材料與方法

1.1 菌株的采集、分離、鑒定

2016年4月和2017年4月分別在上海市嘉定區、青浦區、金山區、閔行區、崇明區等的15個草莓園區隨機采取草莓灰霉病病株，于實驗室內分離，挑單孢培養，鑒定其為灰葡萄孢菌(BotrytiscinereaPers.)。共分離得到319株草莓灰霉病病菌，其中2016年有124株，2017年有195株，所有菌株均采用濾紙片法保存，置于-20 ℃冰箱中，備用。

1.2 供試藥劑

本試驗所用殺菌劑信息如表1所示。

99%水楊肟酸(salicylhydroxamic acid，簡稱SHAM)，由Sigma-Aldrich公司生產，溶于甲醇，配制成20 000 mg/L母液。均放于4 ℃保存備用。

1.3 多菌靈、咪鮮胺、乙霉威的抗藥性檢測方法

采用區分劑量法測定供試菌株對多菌靈、咪鮮胺(prochloraz，簡稱Pro)、乙霉威(diethofencarb，簡稱Die)的抗藥性，多菌靈、咪鮮胺、乙霉威的區分劑量分別設置為10、5、10 mg/L[11]，培養基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基(購自北京奧博星生物技術有限公司)，以不含藥劑的培養基為對照，接種后于23 ℃培養3 d后進行觀察，平板上正常生長的為抗性菌株，不能正常生長的為敏感菌株。所有抗性菌株均進行2次重復再次確認。

表1 試驗所用殺菌劑的詳細信息

1.4 嘧菌酯、吡唑醚菌酯、環酰菌胺的抗藥性檢測方法

采用區分劑量法測定供試菌株對嘧菌酯、吡唑醚菌酯、環酰菌胺的抗藥性，嘧菌酯和吡唑醚菌酯的區分劑量均設置為10 mg/L[12]，環酰菌胺的區分劑量設置為5 mg/L，培養基采用1%麥芽浸粉瓊脂(MEA)培養基，包含氯霉素麥芽提取物瓊脂(購自青島海博生物技術有限公司)和瓊脂粉，以不含藥劑的培養基為對照。為防止旁路氧化[13]，嘧菌酯和吡唑醚菌酯及其對照培養基中均含有100 mg/L SHAM，于23 ℃培養3 d后進行觀察，平板上正常生長的為抗性菌株，不能正常生長的為敏感菌株。所有抗性菌株均進行2次重復再次確認。

1.5 啶酰菌胺的抗藥性檢測方法

采用區分劑量法測定供試菌株對啶酰菌胺抗藥性的濃度為1 mg/L[14]，采用酵母浸出粉胨葡萄糖(YBA)培養基(10 g酵母粉，10 g蛋白胨，20 g醋酸鈉，15 g瓊脂，蒸餾水定容至 1 000 mL)制作藥皿。設不加藥劑的培養基為空白對照，于 23 ℃ 培養2 d后進行觀察，平板上病菌孢子正常萌發、菌絲正常生長的確定為抗性菌株，不能正常生長的確定為敏感菌株。所有抗性菌株均進行2次重復再次確認。

1.6 嘧霉胺、嘧菌環胺的抗藥性檢測方法

采用區分劑量法測定供試菌株對嘧霉胺、嘧菌環胺的抗藥性，兩者的區分劑量均設置為5 mg/L，采用察氏瓊脂(CZA)培養基(2.00 g NaNO3，1.00 g K2HPO4，0.50 g KCl，0.50 g MgSO4，0.01 g FeSO4，30.00 g蔗糖，20.00 g瓊脂，蒸餾水定容至 1 000.00 mL)制作藥皿。設不加藥劑的培養基為空白對照，于 23 ℃ 培養2 d后進行觀察，平板上病菌孢子正常萌發、菌絲正常生長的確定為抗性菌株，不能正常生長的確定為敏感菌株。所有抗性菌株均進行2次重復再次確認。

1.7 數據分析

統計不同地區不同藥劑抗性菌株的數量，分析其抗性水平。不同采樣點菌株抗性頻率的計算公式：抗性頻率=抗性菌株數量/測試菌株數量×100%。

統計并分析抗性菌株的多重抗藥性表型。

2 結果與分析

2.1 上海市不同地區草莓灰霉病病菌種群對藥劑的抗藥性檢測結果

為準確快速區分灰霉病病菌對9種藥劑的抗藥性，以含有藥劑平板上灰霉孢子正常萌發生長的菌株判定為抗性菌株，不能正常萌發生長的菌株判定為敏感菌株。由圖1可知，2016年和2017年采集的灰霉病病菌菌株中未檢測到對咪鮮胺和環酰菌胺產生抗性的菌株，所有供試菌株對咪鮮胺和環酰菌胺均表現為敏感，而對多菌靈、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、乙霉威等的抗性頻率較高。2016年對多菌靈產生抗性的菌株高達81.55%，其次為嘧菌酯、吡唑醚菌酯、乙霉威，其抗性頻率分別為76.14%、74.06%、58.72%。與2016年相比，2017年所采集的菌株對多菌靈、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、乙霉威的抗性頻率均有所下降，分別為60.87%、57.15%、56.46%、42.67%。

2.2 上海市不同地區草莓灰霉病病菌種群對藥劑的抗藥性分布

2016年測定采自嘉定區(30株)、青浦區(52株)、金山區(42株)等3個地區的灰霉病病菌菌株對9種藥劑的敏感性，抗性菌株共計110株，嘉定區、青浦區、金山區的抗性菌株占比分別為80%、92.31%、88.1%，上述3地的草莓灰霉病抗性菌株群體已成為田間主導種群。2017年測定采自閔行區(24株)、嘉定區(45株)、青浦區(70株)、崇明區(56株)等4個地區的灰霉病病菌菌株對9種藥劑的敏感性，抗性菌株共計133株，閔興區、嘉定區、青浦區、崇明區的抗性菌株占比分別為20.83%、100.00%、78.57%、56.36%。由圖2可知，2017年嘉定區供試菌株除了對乙霉威的抗性頻率比2016年略低以外，對其余供試藥劑的抗性頻率均呈明顯上升趨勢，且抗性頻率均高于50%，該地區田間主導種群為抗性菌株群體；青浦區的灰霉病病菌菌株群體與2016年的檢測結果趨勢相當，抗性頻率略有下降，但抗性菌株群體依然是主導種群，而崇明區抗性菌株群體與敏感菌株群體的比例相當，須指出的是閔行區田間灰霉病病菌群體依然以敏感菌株為主導。

2.3 上海地區草莓灰霉病病菌種群多重抗藥性表型分析

根據試驗結果，重點選取了多菌靈(Car)、啶酰菌胺(Bos)、嘧菌酯(Azo)、嘧霉胺(Pyr)等分析多重抗藥性。由圖3可知，2016年和2017年243株抗性菌株的抗藥性表型共有9種。其中，單抗菌株有3種類型，分別為AzoR、CarR、PyrR，分別有9、16、1株，共26株，占總抗性菌株的比例為10.70%；雙抗菌株有3種類型，分別為CarRPyrR、CarRAzoR、CarRBosR，分別有1、64、2株，共67株，占總抗性菌株的比例為27.57%；三抗菌株有2種類型，分別為CarRAzoRPyrR、CarRBosRAzoR，分別有51、53株，共104株，占總抗性菌株的比例為42.80%；四抗菌株類型為CarRBosRAzoRPyrR，有46株，占總抗性菌株的比例為18.93%。2016年多重抗藥性表型以雙抗類型(CarRAzoR)和三抗類型(CarRAzoRPyrR、CarRBosRAzoR)為優勢亞種群，分別占2016年測定菌株總數的25.45%、20.91%、25.45%，而四抗類型占13.64%。與2016年相比，2017年的多重抗藥性表型略有變化，單抗類型AzoR、PyrR、雙抗類型CarRBosR及三抗類型CarRBosRAzoR所占比例略有下降，而其他優勢亞種群所占比例均有所上升，CarRAzoR、CarRAzoRPyrR、CarRBosRAzoRPyrR所占比例分別為27.07%、21.05%、23.31%，其中四抗類型菌株數量上升最多，所占比例由2016年的13.64%上升至2017年的23.31%。上海地區草莓灰霉病病菌的多重抗藥性表型以CarRAzoR、CarRAzoRPyrR、CarRBosRAzoR、CarRBosRAzoRPyrR為優勢亞種群，呈現出單抗類型比例減少多抗類型比例上升的演變趨勢。

3 結論與討論

本試驗于2016年和2017年分別在上海市嘉定區、青浦區、金山區、閔行區、崇明區等采集319株草莓灰霉病病菌菌株，測定了菌株對多菌靈、乙霉威、咪鮮胺、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、環酰菌胺、啶酰菌胺、嘧霉胺、嘧菌環胺等的抗藥性。采集的所有菌株均對咪鮮胺、環酰菌胺表現為敏感，未檢測到抗性菌株，但對多菌靈的抗藥性穩居榜首，這與文獻報道中，江蘇省南京市、鎮江市草莓灰霉病病菌對多菌靈產生了很高的抗藥性[15]相一致。從2年的結果來看，嘉定區灰霉病病菌菌株對嘧菌酯和吡唑醚菌酯的抗性頻率呈上升趨勢，抗性頻率由2016年的70%上升至2017年的 97.78%，抗性菌株已經成為優勢種群?；矢\紅等在2013年也曾報道了浙江省灰霉菌對嘧菌酯的抗藥性也呈現此種趨勢[10]。嘧霉胺和嘧菌環胺的抗藥頻率目前處于抗性發展階段，趙虎等在南京、鎮江等地區采集的菌種中檢測到的草莓灰霉病病菌對嘧霉胺抗藥性高達83%[15]，2016年徐州市草莓灰霉病病菌對嘧霉胺的抗藥性也高達53.76%[16]?？梢姴葺颐共︵酌拱返目剐詥栴}也應引起高度重視。

不同地區由于管理水平和用藥選擇壓力不同，抗性分布并不均勻，閔行區和崇明區相對于嘉定區、青浦區、金山區抗性頻率明顯較低。在閔行區采集的菌株對所有供試藥劑以敏感菌株為主，由此可見，此地區草莓灰霉病病菌以敏感種群為主導，抗性菌株所占比例較小，但生產中仍要注意藥劑的使用次數和輪換交替用藥的原則，保持田間菌株的敏感性，延長各種藥劑的使用壽命。

通過1年的田間指導用藥、藥劑的合理使用培訓等，2017年在青浦區采集到的菌株對多菌靈、乙霉威、吡唑醚菌酯、嘧菌酯等的抗藥性均有所下降，但抗性頻率仍處于70%左右，田間依然以抗性群體為優勢群體，而草莓灰霉病病菌菌株對啶酰菌胺、嘧霉胺、嘧菌環胺等的抗藥性處于平穩期，2年的檢測結果相差不大。由此可見，上海地區草莓產區的灰霉病病菌對多菌靈、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、乙霉威等呈抗性的種群為主導種群。

藥劑間交互抗藥性分析結果表明，大部分灰霉病病菌菌株對多菌靈和乙霉威具有負交互抗性，因此對多菌靈產生抗性的菌株多數對乙霉威敏感，而對多菌靈敏感的菌株，即使從來沒有使用過乙霉威，但其仍對乙霉威表現抗藥性，但本研究發現乙霉威與多菌靈雙抗菌株在2016年高達35%，另有報道乙霉威在研究區田間的高抗群體達10%[15]，而作為多菌靈+乙霉威抗藥性治理的黃金搭檔也不能幸免抗藥性的產生，自20世紀90年代初，世界各國陸續檢測到對多菌靈、腐霉利、乙霉威均具抗性的多抗灰霉菌株，即BenRDicRNpcR[17-19]；而菌株對吡唑醚菌酯和嘧菌酯具有嚴重的正交互抗性，檢測結果中灰霉病病菌對嘧菌酯和吡唑醚菌酯的抗性頻率基本相同；菌株對嘧霉胺和嘧菌環胺也有一定的交互抗性。另外，菌株雖然對啶酰菌胺也產生了抗藥性，但抗性水平均處于低抗水平，2016年和2017年抗性水平比較平穩，相差不大，因此實際生產中加大藥劑使用量，仍然可以較好地防控灰霉病的危害。供試9種藥劑，沒有檢測出對咪鮮胺和環酰菌胺產生抗性的菌株，這2種藥劑對草莓灰霉病病菌依然有很好的防效。

從藥劑的多重抗藥性表型分布來看，從2016年到2017年，單抗菌株逐漸向雙抗菌株發展，三抗菌株逐漸向四抗菌株發展，田間草莓灰霉病病菌的多重抗藥性表型以CarRAzoR、CarRAzoRPyrR、CarRBosRAzoR、CarRBosRAzoRPyrR等為優勢亞種群，由此可見，該地區病菌對藥劑的多重抗藥性處于發展階段，具有明顯的發展趨勢，而且隨著藥劑的使用，單抗類型比例減小，逐漸向多抗類型演變。因此，在生產過程中要注意不同種類藥劑的輪用、混用，避免抗藥性的快速發展。