素花虎頭蘭×黃蟬蘭F1代原球莖再生體系的建立

劉 丹， 徐銘洋， 葉長寧， 李靈麗， 朱瑞玲， 李枝林， 王玉英

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南昆明 650201； 2.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院實訓(xùn)中心，河南商丘 476000)

素花虎頭蘭(黃色素花)(Cymbidiumtracyanumvarhuanghua)為蘭科蘭屬植物，附生于山崖或樹枝上，秋末冬初開花，花為黃綠色素花，花淡香。黃蟬蘭(C.iridioidesD. Don)亦為蘭科蘭屬多年生常綠草本植物，花大，黃色帶褐色條紋，花期4—6月；黃蟬蘭產(chǎn)于西藏南部和東南部，多生于海拔高度為1 300～2 400 m的林緣草叢巖石上[1]。中國蘭作為中國的傳統(tǒng)名花，因其株形幽雅、花姿優(yōu)美、幽香四溢，自古以來深受人們的喜愛[2]，適宜作切花或大型盆栽，具有頗高的觀賞價值。利用傳統(tǒng)雜交育種技術(shù)，獲得蓮瓣蘭金黃素×墨蘭白墨F1代植株，以期選育出具有二者優(yōu)勢的蘭花新品系。蘭花生長周期長、繁殖系數(shù)低，在育種過程造成了不同程度的阻力。隨著人們對蘭屬花卉優(yōu)良性狀需求的日益提高，培育新型蘭屬花卉新品種已成為滿足市場需要的關(guān)鍵。

高頻再生體系是轉(zhuǎn)基因工程成功的關(guān)鍵，構(gòu)建優(yōu)良基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，要求植物材料有高效穩(wěn)定的再生能力和大量穩(wěn)定的外植體來源[3]。研究表明，蘭花轉(zhuǎn)基因研究胚性愈傷組織、懸浮細胞和原生質(zhì)體是較理想的受體系統(tǒng)，但因材料難以獲得，生長緩慢，繼代培養(yǎng)或再生困難，而不適宜廣泛應(yīng)用[4-5]。單子葉植物一般難以從葉片誘導(dǎo)愈傷組織或體胚。在蘭科植物中，原球莖(protocorm-like body，PLB)被認(rèn)為起源于單細胞，相當(dāng)于雙子葉植物體胚。《植物生物學(xué)詞典》(1994年)中將之定義為植株基部由1團尚未分化的薄壁細胞組成的上端有頂端生長點和葉原基，下端有很多不定根、初具球莖形態(tài)的球狀體，是蘭科植物的一種再生方式。目前大量研究表明，通過誘導(dǎo)PLBs可以獲得更高的植株誘導(dǎo)率和繁殖系數(shù)[6-17]；此外相比蘭科其他種，鐵皮石斛的基因序列已注釋[18-19]，石斛的遺傳轉(zhuǎn)化體系較為成熟[20]，石斛已成為蘭科家族理想的遺傳操作模式植物[21]。

然而，目前素花虎頭蘭×黃蟬蘭F1代原球莖受體系統(tǒng)的研究尚未見報道。因此，本試驗通過不同激素配比研究最適宜素花虎頭蘭×黃蟬蘭F1代原球莖受體系統(tǒng)，以期獲得最佳再生體系的培養(yǎng)基材料和配方，為素花虎頭蘭×黃蟬蘭F1代植株產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和轉(zhuǎn)基因工程研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃色素花虎頭蘭與黃蟬蘭雜交F1植株組培苗(TRIR-1)[22]，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院花卉研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 以TRIR-1原球莖為材料的原球莖誘導(dǎo)增殖培養(yǎng) 選擇6-BA、NAA和KT作為外源激素，采用3因素隨機區(qū)組試驗設(shè)計，在1/2MS培養(yǎng)基中，添加不同濃度激素的NAA、6-BA和KT，附加80 g/L香蕉汁、0.5 g/L活性炭和1.5 g/L花寶1號，培養(yǎng)40 d觀察原球莖生長狀態(tài)并統(tǒng)計原球莖增殖倍數(shù)和分化率，篩選出最佳濃度。

1.2.2 以TRIR-1莖尖為材料的原球莖誘導(dǎo)增殖培養(yǎng) 采用3因素隨機區(qū)組試驗設(shè)計，分別設(shè)置植物激素濃度，即NAA(0.1、0.5 mg/L)、6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)和KT(0、0.1、0.5 mg/L)，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加80 g/L香蕉汁、0.5 g/L 活性炭、1.5 g/L花寶1號。培養(yǎng)40 d后觀察原球莖生長狀態(tài)并統(tǒng)計增殖倍數(shù)和分化率，篩選出最佳濃度。

1.2.3 以TRIR-1葉片基部為材料的原球莖誘導(dǎo)增殖培養(yǎng) 以6-BA、NAA和KT作為外源激素，采用3因素隨機區(qū)組試驗設(shè)計，培養(yǎng)于1/2MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+80 g/L香蕉汁+0.5 g/L活性炭+1.5 g/L花寶一號培養(yǎng)基中，附加不同濃度的激素，pH值為5.8，培養(yǎng)40 d后觀察原球莖生長狀態(tài)并統(tǒng)計原球莖增殖倍數(shù)和分化率，篩選出最佳濃度。

1.2.4 生根培養(yǎng) 以株高為2～5 cm的無根苗TRIR-1為材料，采用單因素完全隨機區(qū)組試驗設(shè)計，設(shè)置NAA濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，6-BA濃度為 0.3 mg/L，以 1/2MS 為基本培養(yǎng)基，附加80 g/L香蕉汁、0.5 g/L 活性炭、1.5 g/L 花寶1號，定期觀察生根情況，90 d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.5 培養(yǎng)條件 以原球莖為材料，進行原球莖誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)時先暗培養(yǎng)4周，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)；以莖尖和無菌苗葉片基部為材料時先進行光照培養(yǎng)，10 d后沒有原球莖長出，再轉(zhuǎn)入暗培養(yǎng)(2周)，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。光照度為1 000～1 800 lx，光照時間為12～14 h/d；溫度為22～26 ℃；pH值為5.8。

1.3 數(shù)據(jù)分析

不同材料誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)原球莖階段試驗時分別設(shè)置7個處理，每處理7瓶，每瓶接種5個材料。生根培養(yǎng)階段試驗共設(shè)置5個處理組，每個處理組9瓶，每瓶接種4株無根苗。

統(tǒng)計數(shù)據(jù)用DPS軟件分析數(shù)據(jù)，Duncan’s新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 以TRIR-1原球莖為材料，不同激素配比對TRIR-1原球莖誘導(dǎo)增殖的影響

研究發(fā)現(xiàn)，不同激素配比對TRIR-1原球莖誘導(dǎo)增殖的效果差異顯著(表1)。處理2即1.0 mg/L 6-BA和 0.5 mg/L NAA激素配比對原球莖誘導(dǎo)增殖的效果最佳，增殖倍數(shù)為4.50，顯著高于對照、處理7、處理4、處理3、處理6、處理5，分別高31.58%、36.36%、38.89%、80.00%、85.95%、103.62%(P<0.05)，原球莖呈綠色細小且緊實的顆粒狀，長勢最好，褐變率低，部分分化成小苗。當(dāng)6-BA和NAA組合濃度分別為1.0、0.5 mg/L和2.0、0.1 mg/L時，隨著KT濃度增加，原球莖增殖倍數(shù)呈遞減的變化，這說明低濃度KT有利于原球莖的生長。當(dāng)NAA濃度為 0.5 mg/L，不添加KT時，原球莖的增殖倍數(shù)隨6-BA濃度增加而降低，當(dāng)NAA濃度減小至0.1 mg/L和KT濃度增加至0.1 mg/L時，原球莖的增殖倍數(shù)隨著6-BA濃度的增加而增加，這說明3種激素互相影響。因此，1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 g/L花寶1號+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥是原球莖增殖培養(yǎng)的最佳配方(圖1-A)。當(dāng)6-BA、NAA、KT分別為2.0、0.1、0.1 mg/L時，原球莖的分化率極顯著高于其他處理，分化率達到38.80%。因此，最佳分化培養(yǎng)基為 1/2M+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L KT+1.5 g/L花寶1號+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥。

2.2 以TRIR-1叢生芽為材料，不同激素配比對TRIR-1原球莖誘導(dǎo)增殖的影響

研究發(fā)現(xiàn)，不同激素配比對TRIR-1原球莖誘導(dǎo)增殖的效果差異顯著(表2)。處理2即1.0 mg/L 6-BA和 0.5 mg/L NAA激素配比誘導(dǎo)增殖的效果最佳，增殖倍數(shù)為1.68，顯著高于對照、處理5、處理7、處理3、處理4，分別高80.65%、82.61%、133.33%、236.00%、546.15%(P<0.05)，原球莖淺綠色，輕度褐化，生長狀態(tài)最佳。因此，1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 g/L花寶1號+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥是原球莖增殖培養(yǎng)的最佳配方(圖1-B)。當(dāng)6-BA、NAA分別為1.5、0.5 mg/L時，原球莖的分化率極顯著高于其他處理組合，達到84.32%。因此，最佳分化培養(yǎng)基為1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 g/L花寶1號+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥。

2.3 以TRIR-1無根苗為材料，不同激素配比對TRIR-1原球莖誘導(dǎo)增殖的影響

研究發(fā)現(xiàn)，不同激素配比對TRIR-1原球莖誘導(dǎo)增殖的效果差異顯著(表3)。處理3即1.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA和0.5 mg/L KT激素配比對原球莖誘導(dǎo)增殖的效果最佳，增殖倍數(shù)為0.33，顯著高于處理6、處理5、處理4、對照、處理2、處理7，分別高57.14%、175.00%、371.43%、450.00%、450.00%、∞(P<0.05)， 原球莖為綠色顆粒狀，輕度褐化，長勢一般。因此， 1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L

表1 不同激素配比對TRIR-1植株原球莖誘導(dǎo)、增殖和分化的影響

注：褐化程度(x)指原球莖發(fā)生褐化的比例，+、++、+++分別表示5%≤x≤15%、15%≤x≤30%、x≥30%。同列數(shù)據(jù)后不同小寫、大寫字母表示處理間分別在0.05、0.01水平存在顯著差異；下同。

表2 不同激素配比對TRIR-1植株原球莖誘導(dǎo)、增殖和分化的影響

表3 不同激素配比對TRIR-1植株原球莖誘導(dǎo)、增殖和分化的影響

NAA+0.5 mg/L KT+1.5 g/L花寶1號+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥是原球莖增殖培養(yǎng)的最佳配方(圖1-C)。當(dāng)6-BA和NAA濃度分別為1.0、0.5 mg/L 時，原球莖的分化率極顯著高于其他處理，達到100%，處理7沒有誘導(dǎo)出原球莖，故生長狀況未進行統(tǒng)計。因此，最佳分化培養(yǎng)基為 1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 g/L 花寶1號+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥。

2.4 不同處理對TRIR-1生根效果的影響

研究發(fā)現(xiàn)，不同處理對TRIR-1無根苗生根的效果差異顯著(表4)。5個處理對TRIR-1的生根率均達到100%，處理4的TRIR-1的平均根數(shù)最多，達4.69條，顯著高于處理5、處理3、處理2、對照，分別高23.10%、32.86%、97.89%、115.14%(P<0.05)；處理4的TRIR-1的平均根長最長，達7.31 cm，顯著高于處理5、處理3、處理2、對照，分別高 10.26%、23.06%、31.95%、80.49%(P<0.05)，根毛多，粗壯，生長狀態(tài)最佳。因此，1/2MS+0.3 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+1.5 g/L花寶1號+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥是組培苗的最佳生根培養(yǎng)基(圖1-D)。

表4 不同處理對TRIR-1生根的影響

3 討論與結(jié)論

蘭花大量擴繁的有利階段是原球莖的增殖期，此時期是提高繁殖系數(shù)的核心[23]。原球莖具有繁殖效率高、易于生根等優(yōu)點，是蘭科植物重要的繁殖方式之一[24]。原球莖的誘導(dǎo)增殖受植物材料的種類、外源激素的種類與濃度的影響。本試驗結(jié)果表明，以TRIR-1原球莖為材料，原球莖誘導(dǎo)增殖倍數(shù)顯著高于以TRIR-1莖尖和葉片基部為材料的原球莖增殖倍數(shù)，誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)40 d后，1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 g/L花寶1號+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥的增殖效果最好，原球莖濃綠，生長最快，增殖倍數(shù)達4.50，略高于楊玉珍等在大花蕙蘭原球莖誘導(dǎo)增殖的報道[25]，但低于季華等的報道[26]，這可能與蘭花種類不同有關(guān)，具體原因還須進一步研究。

TRIR-1原球莖為材料誘導(dǎo)增殖原球莖中，當(dāng)6-BA和NAA組合濃度分別為1.0、0.5 mg/L和2.0、0.1 mg/L時，隨著KT濃度的增加，原球莖增殖倍數(shù)呈遞減的變化，低濃度的KT對原球莖增殖有明顯的促進作用，這與楊玉珍等的報道[25，27-28]一致；當(dāng)NAA濃度為 0.5 mg/L、6-BA濃度在1.0～1.5 mg/L范圍內(nèi)，原球莖的增殖倍數(shù)隨著6-BA濃度的增加而降低，這與韓勁峰等的研究結(jié)果[29]一致，但與付志惠等的報道[30-31]不同；本研究發(fā)現(xiàn)1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L KT+1.5 g/L花寶1號+0.5 g/L炭粉+80 g/L香蕉泥的分化率最高，達38.8%，低于常美花等在大花蕙蘭原球莖分化的報道[32]，谷祝平等報道較高濃度的BA能促進大花蕙蘭原球莖的增殖，較低濃度BA促進原球莖分化[33]。因此，本研究分化率的偏低可能與激素濃度有關(guān)，具體原因尚待進一步研究。

王亞沉等對不同NAA濃度對碧玉蘭生根的影響做了研究，發(fā)現(xiàn)生根率均達100%，平均根長為4.6 cm[34]；張晨晨等研究發(fā)現(xiàn)，生根率均達100%，最長根長為3.94 cm[35]。本研究最適生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.3 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+1.5 g/L花寶1號+0.5 g/L活性炭+80 g/L香蕉泥，生根率達到100%，根的數(shù)量最多，平均株根數(shù)為 4.69 條，平均根長為7.31 cm，根粗壯且根毛多，植株生長健壯，葉片濃綠，這與王亞沉等的報道[34]一致，與張晨晨等的報道[35]略有不同。本研究中以TRIR-1莖尖和葉片基部為材料誘導(dǎo)增殖原球莖效果較差，最高增殖倍數(shù)分別僅為1.68和0.33，與前人相關(guān)報道結(jié)果[36-41]不同。