基于線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)序列的洪澤湖湖鱭遺傳多樣性分析

李大命， 張彤晴， 唐晟凱， 關(guān)浩勇， 劉燕山， 穆 歡， 黃越峰， 潘建林

(1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所/江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點實驗室，江蘇南京 210017； 2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210046； 3.江蘇省洪澤湖漁業(yè)管理委員會辦公室，江蘇淮安 223300)

刀鱭(Coilianasus)是一種具有重要經(jīng)濟價值的洄游性中小型魚類，隸屬于鯡形鳀科(Engraulidae)鱭屬(Coilia)。近年來，由于過度捕撈、環(huán)境污染及水利工程建設(shè)等因素，刀鱭天然資源趨于枯竭，保護(hù)刀鱭資源刻不容緩[1-4]。湖鱭是刀鱭的一種，為湖泊定居型，沒有洄游習(xí)性，它已成為我國淡水湖泊漁業(yè)資源的重要組成部分。研究表明，湖鱭和刀鱭在遺傳上沒有顯著差異，屬于同一種類[5-6]。遺傳多樣性是生物多樣性的一個重要方面，決定了物種的進(jìn)化潛能和對環(huán)境變化的適應(yīng)能力。掌握物種的遺傳多樣性水平是物種保護(hù)須要了解的重要內(nèi)容，可以為制定針對性的保護(hù)和管理策略提供科學(xué)依據(jù)。

魚類線粒體DNA是一種閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子，具有結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳、不發(fā)生重組及進(jìn)化速度快等特征，使其成為分子群體遺傳學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)研究的重要分子標(biāo)記[7]。細(xì)胞色素b(cytochrome b，簡稱Cytb)基因的結(jié)構(gòu)和功能在mtDNA的13個蛋白質(zhì)編碼基因中是被了解得最為清楚的，且其進(jìn)化速度適中[8-9]。線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)為非編碼區(qū)，因缺乏編碼的選擇壓力而比其他線粒體基因的進(jìn)化速率更快，富含系統(tǒng)發(fā)育信息[10]。因此，Cytb基因和 D-loop區(qū)序已成為魚類種群遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性研究中常用的2個分子標(biāo)記。

洪澤湖面積為1 597 km2，是江蘇省第二大淡水湖泊，也是我國第四大淡水湖泊，具有漁業(yè)生產(chǎn)、工農(nóng)業(yè)及生活用水、航運、旅游、泄洪行洪等多種功能[11]。洪澤湖漁業(yè)資源豐富，對湖區(qū)經(jīng)濟、社會的發(fā)展有重要作用[12]。最近調(diào)查發(fā)現(xiàn)，洪澤湖有63種魚類，刀鱭在洪澤湖漁業(yè)產(chǎn)量的占比超過50%[13]。受江湖阻隔、過度捕撈和生境破壞等多種因素的影響，洪澤湖漁業(yè)的可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重威脅[13]。到目前為止，尚無有關(guān)洪澤湖湖鱭遺傳多樣性水平的研究報道。本研究采用Cytb基因和D-loop區(qū)序列作為分子標(biāo)記，對洪澤湖湖鱭遺傳多樣性開展研究，這不僅有利于豐富洪澤湖魚類的分子生物學(xué)數(shù)據(jù)，而且可以為湖鱭種質(zhì)資源保護(hù)及合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集和處理

于2016年12月在洪澤湖用刺網(wǎng)捕獲湖鱭，隨機取40尾湖鱭樣本。用無水乙醇固定，帶回實驗室并且置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

取湖鱭肌肉組織用于基因組DNA的提取。采用Takara公司的DNA提取試劑盒提取總DNA，將DNA溶于滅菌超純水，保存于-20 ℃冰箱中備用。

擴增Cytb基因序列的上游引物為L14724(5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′)，下游引物為H15634(5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′)[14]；擴增D-loop區(qū)序列的上游引物為DF1(5′-CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT-3′)，下游引物為DR2(5′-ATCTTAGCA- TCTTCAGTG-3′)[2]。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR體系均為50 μL，包括2×Taq酶混合液(1.25 UTaq酶，0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+)25 μL，各1 μL(10 μmol/L)上、下游引物，1 μL DNA模板，22 μL滅菌超純水。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，53 ℃ 退火(Cytb)或55 ℃退火(D-loop)50 s，72 ℃延伸 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃條件下保存。

PCR產(chǎn)物純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序，測序引物與擴增引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用ClustalX1.83軟件[15]對獲得的Cytb基因和D-loop區(qū)序列進(jìn)行多重比較，并人工校對。采用Mega 5.1軟件[16]分析序列堿基組成和變異位點，利用Kimura雙參數(shù)(Kimura-2-parameter)模型計算單倍型之間的遺傳距離，采用鄰接法(neighbour-joining method，簡稱NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用DnaSP 5.0軟件[17]獲得群體序列遺傳多樣性參數(shù)，包括單倍型數(shù)(N)、單倍型多樣性(h)、核苷酸多樣性(π)、平均核苷酸差異數(shù)(K)。采用Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗，同時結(jié)合核苷酸不配對分布分析檢驗湖鱭種群歷史動態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cytb基因和D-loop區(qū)序列堿基組成

本研究獲得40條1 141 bp的Cytb基因序列，共檢出14個變異位點，其中有9個簡約信息位點、5個單一信息位點，沒有插入和缺失位點。4種堿基的平均含量分別為A(27.8%)、T(30.6%)、G(14.5%)、C(27.1%)，A+T的含量(58.4%)明顯高于G+C的含量(41.6%)(表1)。在第2、第3位點，堿基G的含量最低，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏向性。

表1 Cytb基因序列堿基組成

本研究獲得40條D-loop區(qū)序列，其長度為1 214～1 290 bp，其中26條長度為1 252 bp，占比65.0%；12條長度為1 290 bp，占比30.0%；1條長度為1 328 bp，占比2.5%；1條長度為1 214 bp，占比2.5%。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，D-loop區(qū)序列有4處長度為38 bp的插入或缺失序列。4種堿基的平均含量分別為A(33.3%)、T(33.5%)、G(14.2%)、C(19.0%)，A+T含量(66.8%)明顯高于G+C含量(33.2%)，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏倚性。D-loop區(qū)序列共檢出54個變異位點，其中27個簡約信息位點，27個單一信息位點。

2.2 種群遺傳多樣性參數(shù)

40條Cytb基因序列共定義13個單倍型(Hb1～Hb13)，單倍型Hb6的數(shù)量最多(19個)，占比47.5%；單倍型Hb4和Hb8各有4個，均占比10.0%；單倍型Hb1、Hb3、Hb10各有2個，均占比5.0%；單倍型Hb2、Hb5、Hb7、Hb9、Hb11、Hb12、Hb13的數(shù)量均為1個，占比2.5%。單倍型多樣性為0.762±0.067，核苷酸多樣性為0.002 70±0.000 28，平均核苷酸差異數(shù)為 2.073。40條D-loop區(qū)序列共定義17個單倍型(Hd1～Hd17)，單倍型Hd11數(shù)量最多(21個)，占比52.5%；單倍型Hd3、Hd8、Hd16的數(shù)量均為2個，均占比5.0%；單倍型Hd2、Hd4～Hd7、Hd9～Hd15、Hd17的數(shù)量均為1個，均占比2.5%；單倍型多樣性為0.727±0.078，核苷酸多樣性為 0.006 10±0.001 00，平均核苷酸差異數(shù)為7.378。整體來看，洪澤湖湖鱭種群遺傳多樣性呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。

2.3 單倍型系統(tǒng)樹

基于Kimura雙參數(shù)模型估算湖鱭單倍型之間的遺傳距離，結(jié)果表明，Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.004 之間，D-loop區(qū)序列單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.018之間。

以鳳鱭(Coiliamystus，GenBank登錄號為KF056322.1)為外群，采用NJ法構(gòu)建單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，Cytb基因D-loop區(qū)序列單倍型聚為一支(圖1、圖2)。

表2 洪澤湖湖鱭種群的遺傳多樣性參數(shù)

2.4 種群歷史動態(tài)

基于Cytb基因和D-loop區(qū)序列的中性檢驗結(jié)果(表3)表明，Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗產(chǎn)生的D和Fs均為負(fù)值，其中僅Cytb基因中性檢驗產(chǎn)生的Fs值統(tǒng)計有極顯著差異(P<0.01)，說明Cytb基因序列進(jìn)化顯著偏離中性進(jìn)化。Cytb基因序列核苷酸不配對分布呈單峰類型(圖3)，而 D-loop 區(qū)序列核苷酸不配對分布成多峰型(圖4)。因此綜合來看，洪澤湖湖鱭可能經(jīng)歷了近期種群擴張事件。

3 結(jié)論與討論

遺傳多樣性即基因多樣性，是指種內(nèi)不同群體間或一個群體內(nèi)不同個體的遺傳變異的總和。它不僅是生物多樣性的重要組成部分，也是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ)，更是生命進(jìn)化和物種進(jìn)化的基礎(chǔ)。一個物種的遺傳多樣性與其適應(yīng)能力、生存能力、進(jìn)化潛力等密切相關(guān)[18-19]。物種的遺傳變異越豐富，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強，反之，更容易受到環(huán)境變化的影響[9]。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量物種遺傳多樣性的2個常用參數(shù)。本研究采用線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)序列作為分子標(biāo)記，分析洪澤湖湖鱭的遺傳多樣性。結(jié)果表明，基于Cytb基因的湖鱭單倍型遺傳多樣性和核苷酸多樣性分別為0.762±0.067、0.001 82±0.000 28，平均堿基差異數(shù)為2.073；基于D-loop區(qū)的湖鱭單倍型遺傳多樣性和核苷酸多樣性分別為0.727±0.078、0.006 10±0.001 00，平均堿基差異數(shù)為7.378，顯示出較高的遺傳多樣性。與基于Cytb基因序列相比，基于D-loop區(qū)序列湖鱭種群的遺傳多樣性相對較高，這是因為魚類線粒體D-loop區(qū)序列受到的選擇壓力較小、進(jìn)化速率快，而Cytb基因作為線粒體編碼基因，其進(jìn)化速度相對較慢[7]。已有文獻(xiàn)報道，基于Cytb基因的洞庭湖(h：0.643 3，π：0.002 6)、鄱陽湖(h：0.950 0，π：0.003 4)、太湖(h：0.857 0，π：0.002 1)和巢湖(h：0.901 5，π：0.002)湖鱭的遺傳多樣性水平[20]。可以得出，洪澤湖湖鱭種群的遺傳多樣性水平高于洞庭湖湖鱭種群，低于鄱陽湖、太湖、巢湖湖鱭種群。因此，洪澤湖湖鱭種群的遺傳多樣性水平有待進(jìn)一步提高。與湖鱭相比，基于Ctyb基因的刀鱭遺傳多樣性高于湖鱭[8]。同樣，基于D-loop區(qū)序列的刀鱭遺傳多樣性也高于湖鱭[2-4]。這是因為湖鱭是刀鱭的陸封型群體，由于奠基者效應(yīng)等因素的影響，其遺傳多樣性水平應(yīng)低于刀鱭[8]。

表3 湖鱭種群的中性檢測結(jié)果

整體來看，基于Cytb基因和D-loop區(qū)序列的洪澤湖湖鱭遺傳多樣性呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。有研究者根據(jù)單倍型多樣性和核苷酸多樣性標(biāo)準(zhǔn)，將魚類進(jìn)化情景分為4種類型(低h和低π、高h(yuǎn)和低π、低h和高π、低h和低π)[21]。可以看出，洪澤湖湖鱭遺傳多樣性屬于第2種類型。湖鱭種群的遺傳多樣性現(xiàn)狀被認(rèn)為可能是小的有效種群經(jīng)過一段時間的穩(wěn)定后發(fā)生了擴張，種群快速增長有利于提高對新突變的保持力從而導(dǎo)致核苷酸多樣性降低。已有文獻(xiàn)報道，湖鱭多個地理種群的遺傳多樣性水平均具備這一特征[20]。從種群歷史動態(tài)來看，Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗產(chǎn)生的D和Fs均為負(fù)值，且Cytb基因的Fs值統(tǒng)計結(jié)果具有顯著性差異，表明DNA進(jìn)化偏離了中性選擇[22-23]。同時，Cytb基因序列岐點分布圖呈現(xiàn)為單峰型，表明洪澤湖湖鱭近期經(jīng)歷了種群擴張[24]。

基于Kimura雙參數(shù)模型Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.004之間，D-loop區(qū)單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.018之間。整體來看，單倍型之間的遺傳距離較小，說明洪澤湖湖鱭個體之間的基因交流不受限制。這是因為湖鱭運動能力較強，個體間基因交流不存在地理隔離限制。從單倍型組成來看，13個Cytb基因單倍型中有19個優(yōu)勢單倍型Hb6，占比47.5%，17個D-loop區(qū)單倍型中有21個優(yōu)勢單倍型Hd11，占比52.5%，大多數(shù)僅有1個單倍型。由此可以看出，洪澤湖湖鱭單倍型組成具有不均勻性。一方面優(yōu)勢單倍型的個體適應(yīng)能力強，擁有更大的繁殖群體，而低頻率的單倍型則因環(huán)境適應(yīng)能力差，擁有的繁殖群體較小，更容易對整個種群的遺傳多樣性造成不利影響。因此，須要持續(xù)加強對湖鱭種質(zhì)資源的保護(hù)力度，通過控制捕撈強度、改善水體生態(tài)環(huán)境以及加強資源動態(tài)變化監(jiān)測等措施增加湖鱭資源量，提高其遺傳多樣性水平，改善種群遺傳結(jié)構(gòu)，從而有利于湖鱭資源的可持續(xù)發(fā)展。