基于Illumina高通量測序技術分析草莓表面微生物結構

戴寶玲， 肖英平， 戴賢君， 何祥祥， 王佩佩， 楊 華

(1.中國計量大學生命科學學院，浙江杭州 310018； 2.浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，浙江杭州 310021；

3.浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江杭州 310021)

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)作為一種即食性水果，在冬春季節的市場上是最受消費者歡迎的水果之一。草莓營養豐富，柔嫩多汁，口味酸甜，此外還含有豐富的維生素和人體必需的礦物質和微量元素，素有水果皇后的美譽[1]。草莓廣泛種植于我國南方大部分地區，浙江省作為我國早熟草莓的主產區之一，其生產質量直接關系到東南地區及全國早熟草莓的銷售狀況和食用安全。成熟后的草莓果實嬌嫩多汁，含水量達到95%，因此在成熟過程中，為有害微生物生長提供了豐富的營養物質，極易受到微生物(如細菌、真菌)的感染，成為草莓生長以及食用的安全隱患之一[2]。在我國，微生物學指標中，致病菌是判斷食品衛生的重要依據。因此對食用草莓開展致病微生物檢查與鑒定試驗，探尋草莓食用安全的關鍵控制點是一項關系食品安全的重要工作[3]。然而，傳統的微生物檢測方法相對落后，而高通量測序等新技術的引入，將極大地提高檢測效率和準確性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

利用無菌袋，對浙江省2個地區的8個草莓種植基地進行抽樣，每個地區抽取4個基地，編號分別為JD1、JD2、JD3、JD4、JD5、JD6、JD7、JD8。

1.2 基因組DNA提取及擴增

草莓表面微生物DNA的提取采用ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM(Zymo Research)(真菌/細菌DNA小量提取試劑盒)進行提取。將8個不同基地采集的草莓樣本分別用無菌生理鹽水沖洗后離心，將得到的沉淀用200 μL生理鹽水重懸后加入到鋯鋇珠裂解管(ZR BashingBead lysis tube)，然后按照試劑盒說明書的提取方法操作，提取的DNA進行電泳檢測分析。

以提取的草莓表面細菌DNA為模板，采用引物338 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGAC-TACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌16S rRNA基因V3～V4區進行PCR擴增。

1.3 測序和質量控制

應用Illumina HiSeq 2000測序儀對草莓表面細菌的16S rRNA基因的V3～V4區進行測序。

1.4 生物信息學分析

對于得到的測序原始數據通過QIIME軟件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，V 1.7.0，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)對獲得的序列進行質控和過濾，剔除低質量的DNA序列[4-5]。根據相似性≥97%的原則，將質控的有效序列聚類成系統操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。通過試驗數據分析構建了稀釋性曲線圖來評價所測序量是否覆蓋基地草莓表面細菌的全部類群。采用ChaoⅠ指數、辛普森(Simpson)指數和香農(Shannon)指數等評估樣品微生物物種的多樣性以及其豐富度。將測序的結果利用數據庫進行物種匹配，統計在門和屬水平上的基地草莓表面細菌組成及菌群分布情況，并繪制菌群豐度圖、菌群豐度熱點圖等柱狀圖。基于加權UniFrac距離(weighted uniFrac distance)的分析，用主坐標分析(PCoA)方法處理，比較不同基地所獲得樣品表面微生物結構的差異，繪制PCoA散點圖。

2 結果與分析

2.1 草莓樣品微生物物種豐度及多樣性

通過篩選，在8個不同草莓基地中，最終獲得301 924條有效序列，平均每個基地37 741(范圍：11 438～70 004)條，測序的結果如表1所示，各樣品最終獲得572～924個OTU，各樣品的覆蓋度(coverage)指數范圍為0.987～0.997，表明樣品中的序列幾乎都被檢出，此結果可以反應樣品中的真實多樣性組成。以分別從8個基地隨機抽到的草莓表面微生物樣品的序列數與它們代表的OTU數目構建稀釋性曲線，結果(圖1)可以看出，各樣品曲線相對平坦，更多的測序序列只會產生少量新的OTU，說明測序序列數量合理，測序深度能夠滿足分析要求[6]。進一步進行OTU聚類分析，通過ChaoⅠ指數和ACE指數來評估基地草莓表面的菌群豐度，Simpson指數和Shannon指數來評估菌群的多樣性。

表1 樣品測序概況

2.2 草莓表面細菌菌群結構

從微生物分類門的水平上(圖2)來看，8個基地中，草莓表面微生物較為豐富，主要包含變形菌門、厚壁菌門、藍藻細菌、放線菌門、擬桿菌門、軟壁菌門、綠彎菌門、螺旋體門、酸桿菌門、疣微菌門等。變形菌門、厚壁菌門和藍藻細菌門是基地草莓表面微生物的優勢菌門，分別共占每個基地草莓微生物的80%以上，其相對豐度分別為37.99%(變化范圍為 15.07%～56.85%)、33.55%(變化范圍為21.78%～55.23%)、23.29%(變化范圍為3.10%～7.35%)。8個基地草莓表面微生物的種類無明顯的差異，只是各種微生物的豐度有差異。其中JD1、JD2、JD7草莓表面微生物中，變形菌門細菌均占50%以上。JD4、JD5和JD6草莓表面微生物的厚壁菌門豐度大致相同，在25%～35%之間。李橋通過高通量測序發現土壤中變形菌門和厚壁菌門細菌也為優勢菌種，可能是因為草莓果實貼地生長，直接與土壤接觸，感染了土壤微生物[7]。

從屬的水平上(圖3)進一步分析，8個基地中草莓表面微生物種類較豐富。優勢菌屬主要為布赫納氏菌屬、甲基桿菌屬和葡糖桿菌屬，其相對豐度分別為7.94%(2.19%～44.56%)、4.78%(0.87%～10.02%)和4.49%(0.28%～33.15%)。JD1和JD2含有的微生物相對較多，總體均超過了50%，其中葡糖桿菌屬和布赫納氏菌屬所占比例較大，分別為33.14%和44.56%。JD5、JD6、JD7和JD8甲基桿菌屬較其他菌含量多。

在微生物分類屬的水平上進行分析，從細菌豐度熱點圖(圖4)明顯看出JD4、JD5和JD7分別檢出豐度較高的寡養單胞菌屬、葡萄球菌屬、苯基桿菌屬和埃希桿菌屬，這4種微生物都有一定的致病性。其中JD4寡養單胞菌屬細菌相對豐度為2.04%，它雖不是一個高度致命的病原體，但已成為重要的病原體，被感染患有菌血癥的病人死亡率為14%～69%[8-9]，可引起肺部感染和膽道敗血癥[10]；苯基桿菌屬目前包括5種，在JD5基地草莓表面檢測到其菌群豐度為 1.45%，可引起皮膚感染，形成肉芽腫，能夠寄生在人體內并感染細胞使細胞致病[11]；JD7埃希桿菌屬菌群豐度為0.96%，可引起呼吸道、泌尿道等感染[12]；JD4葡萄球菌屬菌群豐度占0.33%，可引起人和動物的化膿性感染(表2)。另外，JD3檢出瘤胃球菌屬，瘤胃球菌屬存在于牛和綿羊的瘤胃等處，可能來自農家肥的施用。JD8檢測出根瘤菌屬，根瘤菌主要存在于土壤中，具有固氮作用。

2.3 草莓樣品的主坐標分析

通過主坐標分析(圖5)可見，PC1和PC2分別解釋55.45%和18.5%差異性。PCoA圖表明， 各處理樣可分為3個集合，其中JD5、JD6、JD7、JD8聚在一起， 可能是因為這4個基地處于同一地區，所以微生物差異不大，JD1、JD2、JD4聚在一起，而JD3單獨。有些草莓表面被污染的微生物有很大差異，可能是因為草莓基地之間相距較遠，其生長的環境和土質不同。

表2 8個基地4種致病菌相對豐度

3 結論

本試驗應用了Illumina高通量測序技術檢測浙江省8個草莓基地草莓表面微生物，了解其分布情況、菌群結構及生物多樣性間的差異和豐富度，結果發現草莓表面細菌菌群主要分布于10個門，變形菌門、厚壁菌門和藍藻細菌門是基地草莓表面微生物的優勢菌門。在屬的水平上發現草莓表面存在一定的寡養單胞菌屬、苯基桿菌屬、埃希桿菌屬和葡萄球菌屬等病原菌，其衛生安全應該給予重視。基地草莓表面的微生物污染主要來源于基地環境，基地草莓順地生長，不同基地環境及土壤微生物的差異，可能是導致草莓表面微生物多樣性的原因。許多研究已經證實微生物多樣性的變化與熏蒸劑和殺蟲劑有關[13-15]。因此，基地草莓生產者在種植時應注意對土壤和環境實施有效的消毒措施。