2個不同番茄品系fasciated基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

劉 爽

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州 350002)

20世紀(jì)以來，我國番茄生產(chǎn)中畸形果發(fā)生率高達(dá)20%以上，特別是冬春季節(jié)溫室番茄生產(chǎn)中畸形果發(fā)生率更高。在大果型番茄品種中，每一花序最先開的花畸形果發(fā)生最多，以第一花序畸形果發(fā)生率最高，這嚴(yán)重影響番茄的食用品質(zhì)，且果實畸形，外觀品質(zhì)欠佳，亦影響銷售，在生產(chǎn)中造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。因此，許多科技工作者就如何減少番茄畸形果的發(fā)生進(jìn)行了一系列的研究，目前已經(jīng)明確了番茄心室數(shù)是產(chǎn)生畸形果的主要原因，即心室數(shù)越多，果實越大，越易產(chǎn)生畸形果；而隨著心室數(shù)的減少，果實逐漸變小，畸形果亦降低[2-4]。番茄心室的形成既與其本身的遺傳特性有關(guān)[2]，又與植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、溫度、光照、營養(yǎng)等條件有關(guān)，各種外界環(huán)境均是通過影響番茄本身的遺傳基因的表達(dá)而對番茄心室形成起作用的[3-5]。

2008年Cong等利用圖位克隆的方法成功獲得fasciated基因，該基因通過堿基突變或轉(zhuǎn)錄水平的變化控制番茄心室的形成，并經(jīng)過轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗證，確認(rèn)是主要的控制番茄心室形成的基因[6]。本試驗中的2個供試番茄品系是經(jīng)過多代自交已完全純合的材料，分別命名為多心室MLK1和少心室FL1番茄，心室數(shù)差異明顯，但fasciated的序列未知。為了明確該基因在2個供試材料中的序列差異，明確供試番茄材料的心室數(shù)差異是否由fasciated序列差異或是轉(zhuǎn)錄水平差異引起，同時為了進(jìn)一步通過該基因的過表達(dá)和沉默植株研究其調(diào)控機(jī)理，進(jìn)行了本試驗。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌種和質(zhì)粒

1.1.1 植物材料 試驗材料：少心室番茄品系FL1(心室 2～3個)，多心室番茄品系MLK1(心室15個左右)，由筆者所在實驗室經(jīng)多代自交獲得，二者心室數(shù)及果實大小差異明顯。

1.1.2 入門克隆載體 pENTR/D-TOPO?、卡那霉素抗性、pCR?8/GW/TOPO?、壯觀霉素抗性，統(tǒng)一購自美國英杰(Invitrogen)生命技術(shù)有限公司。

1.1.3 植物表達(dá)載體 pMDC141(超量表達(dá)載體)和pB7GWIWG2(Ⅰ)(RNAi載體)，分別以抗潮霉素hyg基因和抗除草劑bar基因作為篩選標(biāo)記，2個載體均由筆者所在實驗室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 菌種 pGEM-T載體及大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生化科技有限公司。

1.1.5 主要試劑 瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒、Gateway LR Clonase Enzyme MixⅡ購自Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶、rTaqDNA聚合酶、LATaqDNA聚合酶以及PrimerSTAR HS聚合酶和dNTP購自大連寶生物工程有限公司。M-MLV RT及RNase抑制劑購自普洛麥格(Promega)公司。其他常規(guī)試劑采用進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 2種不同番茄品系FL1和MLK1中fasciated的擴(kuò)增 根據(jù)Genebank中fasciated的序列EU557674(783 bp)，用Primer 5.0跨基因特異序列進(jìn)行引物設(shè)計，由Invitrogen公司合成。引物序列如表1所示。

提取幼嫩番茄葉片總RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR后用fas-f-1、fas-f-1′分別擴(kuò)增FL1、MLK1番茄中的fasciated基因序列(包括全部的編碼序列)，切膠回收后連入pENTR/D-TOPO?載體中，挑取單克隆，由Invitrogen公司進(jìn)行測序后，進(jìn)行序列比對。

表1 本試驗所使用的引物序列

1.2.2 入門克隆建立及植物表達(dá)載體的構(gòu)建 本試驗采用GATEWAY技術(shù)構(gòu)建植物表達(dá)載體。首先，利用引物fas-f-1、fas-f-1′分別擴(kuò)增FL1、MLK1番茄中的fasciated基因，經(jīng)過膠回收后將該片段分別連接到pCR?8/GW/TOPO?和pENTR/D-TOPO?入門克隆載體中，用通用引物M13+測序驗證序列及連入方向的正確，通過LR反應(yīng)將該基因片段最終置換到表達(dá)載體中，再通過酶切及測序的方式驗證正確后將其通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中去，-80 ℃保存待用。

1.2.3 LR克隆及熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (1)于室溫添加LR克隆反應(yīng)體系(入門載體(PENTR質(zhì)粒DNA)100 ng，目的載體(質(zhì)粒DNA)150 ng，加ddH2O至終體積8 μL)至PCR管內(nèi)。(2)將LR ClonaseⅡ置于冰上，每個樣品加2 μL，柔和混勻(勿抽打)后于25 ℃反應(yīng)1～48 h。(3)每個樣品加1 μL Proteinase K(蛋白酶K)，柔和混勻(勿抽打)后于37 ℃反應(yīng)10 min。(4)取2 μL LR克隆反應(yīng)物加入大腸桿菌E.coli感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上5～30 min。(5)42 ℃熱擊90 s，置于冰上2～3 min，加入500 μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基。(6)37 ℃，100～150 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。(7)4 000 r/min低速離心1 min，取200 μL涂布于含有 100 mg/L 表達(dá)載體抗性的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 2個不同番茄品系FL1和MLK1中fasciated的擴(kuò)增

取兩葉一心時期的多心室和少心室番茄莖尖生長點，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于fasciated擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段包括fasciated的全部編碼序列(34～567 bp)，長為551 bp，如圖1所示。

2.2 2個不同番茄品系FL1和MLK1中fasciated序列比對

用DNAman進(jìn)行序列比對，結(jié)果如圖2所示，2個不同番茄品系中fasciated基因的編碼序列完全一致。

2.3 2個不同番茄品系FL1和MLK1中fasciated表達(dá)載體構(gòu)建的酶切檢測

首先用特異性引物對LR反應(yīng)的單克隆質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR檢測，初步驗證fasciated片段整合進(jìn)入目的載體。然后對RNAi載體通過限制性內(nèi)切酶酶切驗證fasciated片段整合的正確性，特別是RNAi載體中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。對超表達(dá)載體筆者直接進(jìn)行了測序并進(jìn)行序列的比對，測出的序列中帶有部分載體序列(attB序列)，以確保插入序列的完全正確性。

筆者選用了3種酶對構(gòu)建的RNAi載體進(jìn)行酶切驗證，分別是EcoRⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ，如圖3-A所示，用EcoRⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ3種酶切LR反應(yīng)前的載體pB7GWIWG2分別能切出3 237、3 180、2 167 bp的片段；LR反應(yīng)之后的載體用Hind Ⅲ酶切可以切出196 bp的片段以及另外2個大小的片段，這3個片段總長為2 148 bp，因為本連入片段分別在293、488 bp有該酶的酶切位點，XbaⅠ可以切出 584 bp+fas(551 bp)長度的片段，而EcoRⅠ酶切位點位于ccdB基因上，因此LR反應(yīng)后不能切出片段。

對于超表達(dá)載體的構(gòu)建，采用序列比對檢測，測序得到的序列中包括了完整的PCR產(chǎn)物片段(551 bp)，并且測得attB2的互補(bǔ)序列，說明載體構(gòu)建準(zhǔn)確無誤，可以用于下一步的試驗(圖4)。

2.4 2個不同番茄品系FL1和MLK1中fasciated表達(dá)載體PCR檢測

終載體的檢測采用了質(zhì)粒PCR的方法，挑取多個單克隆，以水和空載體質(zhì)粒為對照進(jìn)行PCR，結(jié)果如圖5所示：對照沒有目的片段出現(xiàn)，而選擇的終載體質(zhì)粒擴(kuò)增出了目的片段，說明載體已經(jīng)構(gòu)建成功。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本試驗經(jīng)過擴(kuò)增得到的fasciated基因序列與Cong等的研究結(jié)果一致，說明該基因在相同作物中具有高度保守性，在供試番茄材料的心室差異并不是由于二者的cDNA序列差異造成的；同時也進(jìn)行了2個供試材料fasciated基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的比較，發(fā)現(xiàn)少心室番茄FL1比MLK1的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著[5]。在這一點上，試驗結(jié)果同Cong等是相同的[6]，即在番茄心室數(shù)差異明顯的番茄植株中，fasciated轉(zhuǎn)錄水平差異明顯。因此，為了更深入地研究不同材料中fasciated基因的調(diào)控作用，進(jìn)行了該基因的過表達(dá)與RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建。

對于植物表達(dá)載體的構(gòu)建，采用了Gateway技術(shù)，該技術(shù)可以高效、準(zhǔn)確地構(gòu)建表達(dá)載體，操作簡便，反應(yīng)條件易于控制，反應(yīng)后陽性克隆只通過PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳即可檢測，從而為植物基因功能研究提供了強(qiáng)有力的支持。而筆者采用的方法是在傳統(tǒng)的基礎(chǔ)上略加進(jìn)步的載體構(gòu)建方式，即利用最新的入門克隆載體，該載體上已經(jīng)連入attL序列，這樣就跳過了BP反應(yīng)，直接將純化回收后的PCR產(chǎn)物通過TOPO克隆反應(yīng)連入入門克隆載體就可以進(jìn)行LR反應(yīng)了，與傳統(tǒng)BP加LR反應(yīng)相比更加方便快捷。在選擇入門克隆的時候要注意入門克隆載體與表達(dá)載體的抗性，二者的抗性要求是不同的，這樣也方便后續(xù)篩選陽性克隆，本試驗構(gòu)建RNAi載體的入門克隆在片段連入時對連入的方向也進(jìn)行了選擇，所以在設(shè)計引物時在前引物的5′端增加了CACC 4個堿基。本試驗應(yīng)用的Gateway技術(shù)構(gòu)建載體操作簡單，省去了大量的酶切、測序等驗證步驟，是一種簡便、高效植物表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)。

3.2 結(jié)論

本試驗對供試的2個番茄品系的fasciated基因部分序列(551 bp，包括完整的編碼序列)進(jìn)行了比對，發(fā)現(xiàn)2個供試番茄材料中該基因序列完全一致。

同時利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了fasciated基因的RNAi及超表達(dá)載體，準(zhǔn)備將其分別轉(zhuǎn)錄到少心室番茄FL1和MLK1中去，為進(jìn)一步研究該基因與心室之間的關(guān)系做準(zhǔn)備。