穿心蓮內酯聯合平陽霉素對人口腔鱗癌細胞SCC-9凋亡的影響

王露露，吳萌萌，董靜，徐家根

(南京市口腔醫院、南京大學醫學院附屬口腔醫院藥學部，江蘇 南京 210008)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是口腔癌最常見的病理類型，預后較差。盡管治療進展，OSCC患者的五年生存率在過去10年只有約50%[1]。 OSCC的主要治療方法是手術切除、放療和化療，作為手術前后的輔助治療，可以抑制OSCC的轉移和復發[2]。平陽霉素(PYM)，從我國平陽縣土壤中的微生物鏈真菌產生的博來霉素的單一A5組分，臨床上已用于治療各種類型的癌癥，如頭頸部鱗狀細胞癌，皮膚癌和肺癌[3]。PYM的主要細胞毒作用為結合鐵和直接損傷DNA的能力[4]。然而，PYM的化學耐藥性已經成為其治療OSCC的主要障礙。因此，迫切需要為OSCC治療找到新的更有效的用藥方案。穿心蓮內酯(ANDRO)是從草本穿心蓮屬分離得到的雙環二萜內酯。最近的研究報道稱ANDRO在多種人類癌細胞中發揮抗腫瘤作用[5-9]，并可增強常規化療藥的抗腫瘤作用。然而，ANDRO和PYM組合用于治療OSCC尚未有報道。本研究旨在評估ANDRO聯合PYM在體外對人類OSCC細胞凋亡的影響，并探討相關的分子機制。

1 材料和方法

1.1試劑和抗體ANDRO購自Sigma-Aldrich公司；PYM購自哈爾濱博萊通制藥有限公司； 天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-8及caspase-9一抗購自武漢Proteintech公司；Bcl-2，Bax 購自Cell Signaling公司；山羊抗兔和兔抗小鼠IgG辣根過氧化物酶(HRP)二抗，GADPH一抗購自Santa Cruz 公司。MTT試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。本研究起止時間為2015年1月至2017年4月。

1.2細胞培養SCC-9人口腔鱗癌細胞株從美國菌種保藏中心(ATCC)獲得，常規培養于含有10%胎牛血清(浙江四季青)的DMEM / F-12(Invitrogen公司)中，放置在保持37 ℃的含5%二氧化碳細胞培養箱中。

1.3細胞活力測定通過MTT法測定細胞活力。將細胞以每孔104個細胞的密度接種到96孔板中。細胞貼壁后，用含有0.5 g·L-1MTT的200 mL新鮮DMEM / F-12培養基替換常規培養基，并在37 ℃環境下孵育4 h。棄去培養基后，將紫色甲臢結晶在37 ℃下溶于200 mL二甲亞礬(DMSO)中10 min。在酶標儀上用490 nm波長測量吸光度。

1.4劃痕試驗細胞以5×105個細胞/孔的密度接種于6孔板中。使用200 μL移液管做劃痕，PBS沖洗3次去除刮除細胞。處理及培養24 h后在LEICA顯微鏡中對細胞進行拍照，用LEICA LASV4.2軟件處理細胞圖像。

1.5流式細胞術分析將SCC-9細胞接種在6孔板中，貼壁生長后藥物處理24 h。收集懸浮細胞和貼壁細胞。將細胞重懸于500 μL緩沖液中。隨后加入5 μL Annexin V和5 μL PI，室溫下黑暗處孵育15 min。最后，在1 h內通過流式細胞術分析細胞凋亡。

1.6蛋白質免疫印跡(Westernblot)分析細胞用PBS沖洗2次，然后用含有PMSF的RIPA裂解物裂解30 min。將細胞裂解物在4 ℃下以12 000g離心10 min，收集上清液并儲存在-80 ℃冰箱里直至使用。在SDS-PAGE膠上加等量的蛋白質(50 μg)，蛋白分離后轉移到PVDF膜上。在室溫下用含5%脫脂奶粉的TBST溶液將膜封閉2 h，4 ℃下與一抗孵育過夜。隨后將膜與HRP綴合的抗兔或抗小鼠IgG抗體室溫孵育2 h。ECL發光液顯示條帶，并由Kodak Molecular Imaging 軟件對條帶定量分析。

2 結果

2.1ANDRO增強PYM對人OSCC細胞的抗增殖作用近年的研究已經證實ANDRO和PYM單獨應用都表現出了一定的抗腫瘤活性。本次實驗中，我們用MTT法檢測了不同濃度的ANDRO和5 μmol·L-1的 PYM在不同時間點單獨或聯合應用對SCC-9細胞增殖的影響。結果顯示在不同濃度的ANDRO和5 μmol·L-1PYM 作用下SCC-9細胞的生長受到了顯著的抑制，并呈現出時間和劑量依賴性。此外，用不同劑量的ANDRO和PYM組合對人OSCC細胞的增殖的影響顯著高于ANDRO或PYM單獨應用。所有濃度組的ANDRO與PYM聯合對SCC-9細胞均具有顯著的協同抗增殖作用 (圖1)，特別是50 μmol·L-1ANDRO和5 μmol·L-1PYM的劑量組合，細胞增殖的抑制率為29.00%±4.32%，而相同劑量的PYM和ANDRO單獨顯示抑制率分別為14.66%±2.05%和18.33%±3.68%(圖2)。由于ANDRO(50 μmol·L-1)和PYM(5 μmol·L-1)的組合具有最佳的抑制細胞增殖協同能力，隨后所有的實驗將選擇這一劑量組合。

圖1 穿心蓮內脂聯合平陽霉素對SCC-9細胞的抗增殖作用

圖2 穿心蓮內脂聯合平陽霉素對SCC-9細胞的生長抑制作用

劃痕試驗結果顯示在ANDRO、PYM或兩者聯合作用24 h后，SCC-9細胞的遷徙能力同樣受到了顯著抑制(表1)。這些與MTT結果一致的數據表明，ANDRO對PYM的抗SCC-9細胞增殖、遷徙作用具有協同效應。

表1 各組細胞凋亡率及遷徙能力的測定結果

注：與對照組相比，aP<0.01;與PYM或ANDRO組相比，bP<0.01

2.2ANDRO增強PYM誘導的SCC-9細胞凋亡

為了確定ANDRO對SCC-9細胞凋亡的敏感性，并檢測ANDRO是否可以增加PYM誘導的SCC-9細胞凋亡，我們通過AnnexinV-FITC和PI雙染色的流式細胞術來定量凋亡細胞。結果表明用PYM或ANDRO處理24 h后，細胞凋亡率分別為14.72%±0.85%，18.57%±0.86%，PYM和ANDRO均可誘導SCC-9細胞產生一定的凋亡，而PYM和ANDRO聯合誘導的凋亡細胞率顯著高于二者單獨應用(31.32%±0.62%)，見表1。

2.3ANDRO/PYM聯合改變了BAX、Bcl-2蛋白的表達Western blot用于檢測凋亡相關蛋白BAX、Bcl-2的表達。結果表明在PYM、ANDRO或兩者聯合處理24 h后，Bcl-2蛋白的表達均呈現了不同程度的降低，而Bax的表達則有不同程度的升高。與單一應用ANDRO或PYM相比，二者聯合應用后細胞中Bcl-2蛋白表達顯著降低，而Bax表達顯著升高(圖3，表2)。

圖3 各組細胞中凋亡相關蛋白的表達

2.4ANDRO/PYM聯合激活了caspase凋亡途徑中相關蛋白的活性為了進一步確定誘導細胞凋亡的相關分子機制，我們檢測了caspase相關蛋白的表達。如圖3所示，與對照組相比， ANDRO/ PYM聯合處理24 h后，SCC-9細胞中caspase-9、caspase-3被激活。與單一應用ANDRO或PYM相比， caspase-9、caspase-3的活性顯著增強。然而，caspase-8的表達在四組中幾乎沒有變化(表2)。以上結果表明，caspase-9依賴的內源性線粒體途徑參與了ANDRO / PYM誘導的SCC-9細胞凋亡。

表2 各組細胞中凋亡相關蛋白表達的測定結果

注：與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01；與PYM或ANDRO組相比，cP<0.05，dP<0.01

3 討論

與單藥治療癌癥相比，聯合用藥具有延緩物耐藥性、降低毒副作用、提高治療效果的優點。最近研究表明，ANDRO，一種二萜類內酯，具有抗炎、免疫調節和抗菌等多種生物活性[10]，已被用于治療炎癥、流感、腹瀉等感染[11]。同時，ANDRO對多種人類癌細胞有顯著的抑制增殖作用，ANDRO聯合常規化療藥物在人結腸癌細胞、卵巢癌[12]、HeLa和HepG2細胞[13]中具有協同抗腫瘤作用。然而，關于ANDRO對PYM在人類OSCC細胞中的療效的影響了解甚少。在本研究中，我們證實了ANDRO與PYM聯合激活了caspase-9及下游的caspase-3活性，表明兩者聯合可以通過caspase-9依賴的內源性線粒體途徑顯著抑制人類OSCC細胞SCC-9的增殖，促進了細胞凋亡。我們的研究結果表明：(1)ANDRO抑制SCC-9的生長，并增強了PYM對SCC-9細胞的毒性作用;(2)ANDRO / PYM聯合對誘導SCC-9細胞的凋亡具有協同效應;(3)ANDRO/PYM可通過caspase-9依賴的線粒體途徑誘導SCC-9細胞的凋亡。

迄今為止，已知存在兩種主要的凋亡途徑：一種是caspase-8激活的外源性途徑，另一種是caspase-9激活的內在途徑。內在的線粒體途徑包括通過激活不同底物誘導細胞凋亡[14]。外源信號通路涉及死亡受體介導的相互作用，銜接蛋白FADD的募集及與caspase-8相關聯以形成死亡誘導信號傳導復合物(DISC)。活化的caspase-8直接激活caspase-3，隨后激活PARP蛋白。內在的線粒體途徑通常涉及線粒體跨膜電位的喪失和細胞色素C從膜間隙釋放到胞質溶膠中。細胞色素C進而激活Apaf-1以及caspase-9，形成凋亡抑制因子，導致caspase-9的活化，從而激活caspase-3[15]。在我們的研究中，我們用MTT、劃痕試驗證實了ANDRO可增強PYM抑制SCC-9細胞增殖的能力。此外，我們的研究結果表明，ANDRO與PYM的聯合以協同方式誘導SCC-9細胞凋亡，與Bax的上調，Bcl-2的下調及caspase 9，caspase 3和PARP的活化相關。然而，四組中caspase-8的表達沒有顯著差異。

總之，我們的研究數據表明，ANDRO可通過caspase-9介導的內源性線粒體凋亡途徑，增強PYM在體外抑制OSCC細胞的增殖，促進OSCC細胞的凋亡。因此，ANDRO和PYM的聯合治療可能成為OSCC治療的新方法。下一步需進行動物實驗來驗證體外實驗的結果。