象草不同輻射劑量誘變系表型及遺傳變異研究

武炳超，張歡，童磊，杜昭昌，胡家菱，陳燚，張新全，劉偉，黃琳凱

(四川農業大學草業科學系，四川 成都 611130)

狼尾草屬(Pennisetum)隸屬禾本科黍亞科, 蒺藜亞族, 為一年生或多年生禾本科牧草, 主要分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區, 全世界約140種, 多數原產于非洲[1]。我國人工栽培利用的品種主要有多年生的象草(P.purpureum)、一年生的美洲狼尾草(P.americanum)及二者之間的雜交種等。

象草，別名紫狼尾草。20世紀40年代初，我國的四川、廣東從印度、緬甸引入試種，后傳入湖南、江蘇、福建等地，目前我國南方各省均有栽培[2]。象草是一種莖稈粗高、含糖量大、粗蛋白和無氮浸出物含量高的優良牧草[3]。1975年，廣東、廣西等地一些畜牧場大面積種植象草飼喂奶牛，取得良好成效[4]。象草因其生長速度快、適口性好、營養價值豐富等特點被多種家畜喜食，其多作為青刈飼料，也可以青貯或者調制干草[5]。象草不僅僅是一種優良的牧草，它還是一種重要的生物質能源植物。美國在20世紀80年代展開了將象草作為能源植物的研究工作，證明了其可以用于乙醇、沼氣和電能的生產[6-9]。除此之外，象草還通過其高大的植株、豐富的葉片、分蘗以及發達的根系保護了土表，發揮著重要的生態效益[10]。近年來，因其株型優美、抗逆性強、管理粗放、維護費用低等特點，已成為一種新型的園林造景植物[11]。

目前我國的國審狼尾草品種中有6個是象草品種，其中4個為引進品種，品種資源匱乏已經成為象草進一步育種和利用的障礙。象草為4倍體，有28條染色體[12]。由于不能形成花粉或者雌蕊發育不良，因而一般不結實或結實率低，種子活性低，生產多用種莖繁殖，種質資源遺傳多樣性低，限制了其育種利用[13-14]。誘變育種技術作為一種有效創造新種質的育種手段，已經廣泛應用于植物育種研究中[15]。其中γ射線可以通過輻射能量使生物體內各種分子產生電離和激發，形成自由原子或者基團，他們相互反應并與周圍大分子核酸和蛋白質起反應，引起染色體結構變異，主要為易位、倒位和缺失[16-17]。為了創制新的象草種質資源，豐富象草種質資源多樣性，本實驗用60Co-γ射線照射受體材料，對誘變系材料表型性狀變異進行初步研究，并輔以分子標記的方法比較誘變系與對照材料之間的遺傳差異，探究輻射誘變對象草遺傳變異的影響，并確定最適宜的輻射誘變劑量，為以后的誘變系選育和品種改良提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

種植在四川農業大學成都崇州實驗基地的象草061023003,來自中國熱帶農業科學院牧草種質基因庫，均為同一無性系擴繁所得，以保證所選材料遺傳背景相同。挑選長勢相近且健康的植株割取種莖，種莖標準為含有2～3個莖節。

1.2 試驗方法

1.2.1象草臨界劑量與半致死劑量確定 2016年4月，將待輻射的種莖送往四川省農科院輻射中心，采用60Co-γ射線進行照射，在運送過程中通過灑水保持種莖濕潤以減弱缺水對種莖的傷害。結合以前的研究，本試驗共設置了3個劑量梯度：10、20和30 Gy，劑量率1 Gy·min-1，以沒有經過輻射處理的材料作為對照。每個劑量梯度分別輻射66個種莖。將輻射后的種莖種植于四川農業大學崇州實驗基地，莖稈傾斜插入土壤，以土壤覆蓋一個莖節為準，株距1 m，行距2 m，常規大田栽培管理，一個月后統計成活率。其中，存活率為50%時的劑量為半致死劑量，存活率為40%時的劑量為臨界劑量[18]。

1.2.2植株表型性狀測定 等待存活的植株生長成熟后，對每個誘變系群體隨機選取15株進行形態指標測定。共測定6個指標，包括株高，分蘗數，莖節數，葉長，葉寬及莖粗。其中葉長、葉寬兩個指標選擇從下至上倒數第2片葉子進行測量，葉寬選擇葉片最寬處測量。除自然高度和分蘗數以外，其余指標均重復測量5次。

1.2.3SSR分子標記 3個誘變系群體選擇的植株同表型分析的植株，對每個存活材料隨機挑選2片健康的葉片，采用DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini kit (Qigene公司，美國)提取DNA。用分光光度計檢測DNA濃度，合格DNA樣品用TE稀釋至20 ng·μL-1。PCR反應體系為15 μL，包括DNA 1.5 μL(20 ng·μL-1)，Taq酶0.3 μL，Master Mix 7.5 μL，上游引物和下游引物各0.6 μL(10 pmol·μL-1)，ddH2O 4.5 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。得到的擴增產物用8%聚丙烯酰胺凝膠在350 V電壓下電泳155 min，再用濃度為1 g·L-1的AgNO3染色15 min，顯影后照相保存。引物由本課題組象草轉錄組測序數據開發，序列交由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。以3個誘變系群體中形態變化差異較大的單株DNA為模板，從50對SSR引物中篩選出20對多態性高、特異性強、條帶清晰的引物。

1.3 數據處理

對于形態指標采用Microsoft Excel 2007軟件處理實驗數據，采用統計分析軟件SPSS 19.0進行方差分析。對電泳得到的膠片進行標準化處理：在相同遷移位置，對穩定且清晰的條帶進行統計，有帶記為“1”，無帶記為“0”，建立原始矩陣。根據表征矩陣，利用Excel 2007統計SSR擴增產物的條帶總數(total number of bands,TNB)和多態性條帶數(number of polymorphic bands,NPB)，計算多態性條帶所占的比率(percentage of polymorphic bands,PPB)和引物多態性信息含量(polymorphism information content,PIC)。使用Popgene 32軟件計算3個誘變系群體的基因多樣性、Shannon信息指數、多態性位點及多態性百分率,利用NTSYSpc 2.1(Version 2.10s)軟件計算遺傳相似系數(genetic similarity coefficient,GSC)并用Past 3繪制UPGMA聚類圖，以探究誘變系與對照材料間的親緣性。

2 結果與分析

2.1 象草輻射后存活率

經過60Co-γ射線輻射后，得到3個誘變系群體，植株存活率隨著輻射劑量的增加而降低。當劑量為10 Gy時，存活植株數為62株，存活率為93.94%，輻射劑量為20 Gy時，存活植株數為49株，存活率為74.24%，而當劑量為30 Gy時，植株存活數為28株，存活率為42.42%，而對照組植株存活率為100%，預測30 Gy可能是象草的誘變適宜劑量。

2.2 未輻射象草與誘變系群體材料的表型差異

在3個誘變系群體中分別隨機選取15株進行形態指標的測量，發現3個誘變系群體中均有一個或多個形態指標與對照組群體存在顯著或極顯著差異(表1)。其中，10 Gy誘變系群體中，僅有葉長一個指標與對照群體差異顯著；20 Gy誘變系群體中株高、葉長、葉寬3個形態指標與對照群體差異顯著，其中葉長和葉寬兩個指標均達到極顯著差異水平；30 Gy誘變系群體中，共有4個形態指標與對照群體差異顯著，其中株高和葉寬與對照群體差異極顯著。

進一步對3個群體各形態變異系數進行計算(表2)，結果表明，除了葉長外，其余形態變異系數均在30 Gy誘變系群體中最大，說明該群體是差異最明顯的誘變系群體。對3個群體中不同形態變異系數進行比較，發現在10 Gy群體中最容易發生變異的形態依次為葉長、分蘗數、莖節數；在20 Gy群體中，最容易發生變異的形態依次為莖節數、葉長、分蘗數；而在30 Gy群體中，依次為莖節數、分蘗數、葉長。由此可見，分蘗數、莖節數和葉長對60Co-γ射線最為敏感，容易在受到輻射后發生變異。

表1 不同劑量輻射誘變系形態變異Table 1 The morphological variation of mutants by different dose of radiation

注： *代表在0.05水平與對照差異顯著；**代表在0.01水平與對照差異極顯著。

Note: * and ** indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

表2 各誘變系不同形態指標的變異系數Table 2 The coefficient of variation of morphological in different mutants group (%)

2.3 SSR標記差異

2.3.1遺傳多樣性分析 篩選出的20對引物共擴增出116條清晰可見的條帶，擴增片段大小為50～300 bp(圖1)，其中多態性條帶91條，多態性條帶比率為78.45%。每對SSR引物擴增的條帶數為3～8條，平均條帶數為5.8條，多態性條帶數為1～8條，平均為4.6條。多態信息含量(PIC)在0.032～0.758，平均為0.273，其中引物c104424_g1的PIC最大，引物c106150_g1的PIC最小(表3)。對3個誘變系群體的基因多樣性、Shannon信息指數、多態性位點及多態性百分率進行比較(表4)，發現在30 Gy誘變系群體中的4項指標均高于另外兩個誘變系群體，說明30 Gy的60Co-γ射線較另外兩個劑量能引起更多的遺傳變異，更加豐富的基因多樣性。

圖1 引物c100123_g1擴增產物電泳圖Fig.1 The amplification product electrophoresis of primer c100123_g1 M代表Marker，A1～A7分別代表F10-41、F10-42、F10-43、F10-45、F10-49、F10-52、F10-54，B1～B6分別代表F20-40、F20-46、F20-47、F20-51、F20-53、F20-54，C1～C7分別代表F30-38、F30-39、F30-40、F30-41、F30-42、F30-43、F30-44，CK代表對照材料。M stands for Marker; A1-A7 represent F10-41、F10-42、F10-43、F10-45、F10-49、F10-52、F10-54, respectively; B1-B6 represent F20-40、F20-46、F20-47、F20-51、F20-53、F20-54, respectively; C1-C7 represent F30-38、F30-39、F30-40、F30-41、F30-42、F30-43、F30-44, respectively; CK stands for control material.

2.3.2遺傳相似性及SSR標記位點差異分析 根據SSR引物擴增出的條帶，計算各誘變系群體與對照材料之間的遺傳相似系數。從表5中可知，對照材料與誘變系材料之間的遺傳相似系數在0.3793～0.9741，平均值為0.8565。3個誘變系群體與對照材料的遺傳相似系數有一定差異，在10 Gy誘變系群體中，遺傳相似系數在0.8017～0.9655，平均為0.8856；在20 Gy誘變系群體中，遺傳相似系數為0.7069～0.9741，平均為0.8563；在30 Gy群體中，遺傳相似系數為0.3793～0.9655，平均為0.8276。說明30 Gy誘變系群體與對照材料遺傳差異最大，發生的變異最多。在所有的誘變系材料中，F30-41與對照材料的遺傳相似系數最小，為0.3793，該材料與對照材料的遺傳差異最大，而F20-44與對照材料的遺傳相似系數最大，為0.9741，說明與對照材料的遺傳差異最小，親緣性最近。

表3 20對SSR引物序列及其擴增結果Table 3 20 SSR primers used in this study and their amplification results

表4 3個誘變系群體基于SSR標記的多態性分析Table 4 Polymorphism analysis of three mutants based on 20 SSR

表5 誘變系與對照材料間的遺傳相似系數Table 5 The genetic similarity coefficient between mutants and control materials

注：編號“F數字1-數字2”的數字1是輻射劑量，數字2是植株編號。下同。

Note: ID: “F number 1- number 2”, where number 1 is the dose of60Co-γ and number 2 is the plants’ number. The same below.

表6 對照材料與誘變系間的SSR標記差異Table 6 The difference of SSR markers between the base material and its mutants

圖2 誘變系的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of mutants

根據擴增條帶， 對誘變系材料和對照材料間的差異位點數進行統計(表6)。發現在10 Gy誘變系材料與對照材料間的差異位點數在4～23個，平均13.3個；20 Gy誘變系材料與對照材料間的差異位點數在3～34個，平均16.7個；而30 Gy誘變系材料與對照材料間的差異位點數在4～66個，平均為19.3個。其中F30-41差異位點數達到66個，差異位點百分率為56.9%，說明該材料與對照材料間的遺傳差異最大。其次是F30-39，差異位點數達到65個，差異位點百分率為56.0%；而F20-44僅有3個差異位點，差異位點百分率為2.6%，說明該材料與對照材料間的遺傳差異最小。該結果與遺傳相似性分析結果一致，均說明當象草莖稈受到30 Gy的60Co-γ射線輻射時，更易引起變異。

圖3 突變體F30-39Fig.3 Mutants F30-39

2.4 UPGMA聚類分析

進一步對輻射后誘變系材料進行非加權平均法(UPGMA)聚類分析，以進一步探究不同輻射劑量所得誘變系材料與對照材料之間的親緣關系。以所得條帶原始矩陣構建親緣關系系統樹(圖2)。由圖可見，所有材料可分為兩類，F30-39(圖3)與F30-41聚為一類且與對照材料遺傳距離最遠，說明它們的變異程度最大。而F20-44與對照材料聚為一類，說明幾乎沒有發生變異。而其他誘變系材料在不同距離與對照材料分開，說明其受到60Co-γ射線照射后，均產生不同程度的變異。

3 討論

不同的物種以及不同部位輻射對60Co-γ射線的敏感性不同，因此篩選最適宜的誘變劑量是輻射誘變育種的基礎。王文恩等[19]使用60Co-γ射線輻射野牛草(Buchloedactyloides)干種子，初步確定了促進野牛草干種子萌發的適宜輻射劑量為100～150 Gy，而日本結縷草(Zoysiajaponica)干種子輻射育種的半致死劑量為480 Gy[20]。以象草種莖為輻射材料進行誘變的報道較少，采用3個劑量的60Co-γ射線對象草種莖進行輻射，發現30 Gy誘變系群體的存活率為42.42%，接近臨界劑量的存活率，故推測30 Gy為象草種莖輻射誘變的適宜劑量。

象草不僅可以為草食動物提供大量優質牧草[21]，還具有一定的觀賞效果[22]。對輻射誘變系與對照材料表型性狀進行測定和分析是發現新品系的基礎。曾捷等[23]用60Co-γ射線輻射扁穗牛鞭草(Hemarthriacompressa)后，發現75%的誘變系葉片變小、株高變矮、莖變細。張彥芹等[24]也通過利用60Co-γ射線輻射高羊茅(Festucaelata)分化苗，得到了葉片變小、變細的高羊茅突變體。對狗牙根(Cynodondactylon)進行輻射誘變后，發現草層高度顯著降低，并且顯著影響了葉寬、葉長及節間直徑和密度[25]。本試驗發現3個誘變系群體的株高、莖節數、莖粗、葉長及葉寬等形態指標與對照材料相比，均有一個或多個指標顯著或極顯著減小，其中分蘗數、莖節數和葉長對60Co-γ射線最敏感，變異系數較高。此結果與前人研究結果基本一致，輻射誘變更傾向于產生植株變小的突變體[23-24]。其中，F10-42和F10-49的株高和莖節數均大于對照材料，是將來進行牧草育種的有潛力的新種質。

SSR標記是共顯性分子標記，多態性豐富、易于鑒別基因型，被認為是最好的研究群體遺傳變異的分子標記之一[26]。例如黃婷等[27]利用SSR標記對6個多花黑麥草(Loliummultiflorum)品種進行遺傳差異分析并對品種進行有效的鑒定。本試驗通過篩選得到的20對SSR引物，對3個誘變系群體與對照材料的遺傳差異進行了鑒定，發現30 Gy誘變系群體的基因多樣性為0.36，Shannon信息指數為0.51，多態性位點89個，多態位點百分率76.72%，遺傳相似系數為0.8276，差異位點數19.3個,均大于10和20 Gy誘變系群體，表明該劑量更易產生豐富的遺傳變異。對所有誘變系群體進行UPGMA聚類分析，發現F30-39和F30-41聚為一類，與對照材料距離最遠，說明其遺傳差異最大，而其他材料也與對照材料不同程度的分開，說明不同劑量的60Co-γ射線均有可能產生突變體。甘蔗(Saccharumofficinarum)品種桂糖22號就是由60Co-γ射線輻射誘變育成的[28]。劉天增等[29]利用輻射誘變方法篩選海濱雀稗(Seashorepaspalum)突變體。甜菜(Betavulgaris)的耐旱突變體也是由輻射得到的，并且用ISSR分子標記進行了鑒定[30]。秦家友等[31]利用SSR標記對玉米(Zeamays)輻射誘變系進行遺傳差異研究，發現誘變系與基礎材料間存在真實的遺傳差異，本研究結果與此一致。本研究的結果僅僅鑒定了不同誘變系群體與對照材料之間分子水平上的遺傳差異，確定了最適宜象草種莖輻射的60Co-γ射線劑量，對于突變體的突變原因以及可能發生突變的基因的鑒定還有待進一步深入研究。

4 結論

不同劑量的60Co-γ射線均可誘導象草發生變異，其中分蘗數、莖節數和葉長對60Co-γ射線最為敏感，容易發生突變。結合不同劑量輻射誘變系表型及遺傳變異的結果，發現30 Gy的誘變效率最高，可作為最適宜象草種莖輻射誘變的劑量。同時發現兩個顯著矮小化的突變體F30-39和F30-41，可為象草后續育種及基因挖掘研究提供材料。