添加5種植物酚類化合物對高精料底物瘤胃體外發酵及產甲烷的影響

魏歡，李翔宇，于全平，陳勇

(新疆農業大學動物科學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

甲烷是僅次于二氧化碳的主要溫室氣體，溫室效應是二氧化碳的21倍[1]。自20世紀以來，就已報道了甲烷在大氣中的濃度不斷增加，在全球范圍內，平均每年釋放的甲烷為5.5×108t，而反芻動物釋放的甲烷約為8.5×107t，占全球甲烷排放的15%[2]。除了影響全球變暖外，反芻動物養殖所釋放的甲烷約使可消化能的8%～14%損失[1]。近年來，植物次生代謝物在抑制瘤胃甲烷產生中顯示出潛在的應用價值。Jayanegara[3]對苯甲酸、苯乙酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、肉桂酸等酚酸化合物進行研究發現，當添加水平達到5 mmol·L-1時，均有降低甲烷產生的作用。Oskoueian等[4]報道，4.5%(占底物干物質)的楊梅素、柚皮苷、槲皮素等黃酮化合物在體外具有抑制瘤胃微生物產甲烷的作用。核桃(Juglansregia)青皮提取物具有明顯的抑菌作用，其中主要活性成分為植物酚酸、黃酮類化合物和胡桃醌；在植物酚酸中又以對羥基苯甲酸、丁香酸、鞣花酸和單寧酸含量最高，黃酮類化合物則以蘆丁最高[5]。這些植物次代謝物在高精料條件下是否也具有抑制甲烷的產生尚未見報道。通過探討單寧酸、對羥基苯甲酸、鞣花酸、丁香酸和蘆丁對瘤胃體外發酵和產甲烷的影響，為尋找新的產甲烷抑制劑和核桃青皮提取物的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 體外培養

單寧酸、對羥基苯甲酸、鞣花酸、丁香酸和蘆丁均購自BBI LIFE SCIENCES，純度均>98%。體外發酵試驗于2017年6月至10月在新疆農業大學動物營養實驗室中進行。植物酚酸或蘆丁添加量為0、0.05%、0.10%和0.20%(w/v)共4個水平，每個處理3個重復。體外發酵采用ANKOMRF體外產氣系統進行。發酵底物0.50 g，精粗比為65∶35，組成為粉碎玉米0.195 g、豆粕0.130 g、玉米秸稈0.175 g。人工唾液的配置參考Goering等[6]的配方配制。瘤胃液采集前24 h配制緩沖液，充分通入CO2，置于39.5 ℃水浴搖床，過夜。采集新鮮瘤胃液，經4層紗布過濾，與人工唾液按照1∶4的比例混合均勻，繼續通入CO2直至紅色褪去后，每個培養瓶分裝200 mL，39.5 ℃厭氧培養48 h。

1.2 樣品采集及測定

采用Gas Pressure Monitor軟件記錄體外發酵產生的氣體。發酵至24 h時利用集氣袋收集氣體，以甲烷標準氣體為外標，采用氣相色譜法測定發酵氣體中的甲烷；色譜條件為進樣口170 ℃，柱溫箱40 ℃，保持2 min，FID檢測器200 ℃。待發酵48 h后，將培養瓶放入冰水中以終止發酵，并測定發酵終點pH值。NH3-N采用靛酚藍比色法測定。以4-甲基戊酸為內標，采用氣相色譜法測定發酵培養基中的揮發性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)；色譜條件為進樣口230 ℃，柱溫箱起始溫度55 ℃，以13 ℃·min-1升溫到200 ℃后保持0.5 min，FID檢測器240 ℃。

1.3 數據分析

采用Excel 2007軟件處理原始數據，統計分析采用SPSS 18.0統計軟件中的“一般線性模型”進行，同時分析添加酚化合物的線性和二次效應，多重比較采用Duncan’s新復極差法進行。

2 結果與分析

2.1 植物酚酸和蘆丁對體外發酵后pH、NH3-N、累積產氣量和產甲烷的影響

由表1可知，添加單寧酸對產甲烷無顯著影響(P>0.05)；增加單寧酸添加水平顯著降低發酵終點pH和NH3-N濃度(P<0.05)，并顯著增加24和48 h累積產氣量(GP24、GP48)(P<0.05)。隨著單寧酸水平的增加，pH呈顯著的線性降低(P<0.05)，NH3-N濃度呈顯著的線性和二次降低(P<0.05)，但GP24和GP48線性升高(P<0.05)。當添加水平達到0.20%時，pH和GP48分別顯著低于和高于其他各組；與對照組(Ⅰ組)相比，添加單寧酸后均顯著降低NH3-N濃度。

表1 添加植物酚酸及蘆丁對體外發酵后pH、NH3-N、累積產氣量及產甲烷的影響Table 1 Effects of phenolic acids and rutin on pH, NH3-N, cumulative gas production and methane production in in vitro fermentation

注：同行無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。M: 主效應；L: 線性效應；Q: 二次效應。下同。

Note:In the same row, values with no letter meant no significant difference (P>0.05), while with different small letter meant significant difference (P<0.05). M: Main effect；L: Linear effect；Q: Quadratic effect. The same below.

添加對羥基苯甲酸對pH、GP48和產甲烷無顯著影響(P>0.05)；與對照組相比，添加劑量達到0.10%和0.20%時，使NH3-N濃度顯著降低(P<0.05)，而GP24顯著升高(P<0.05)。隨著對羥基苯甲酸水平的增加，線性降低NH3-N濃度(P<0.05)，GP24和GP48線性升高(P<0.05)。

與對照組相比，當鞣花酸添加水平達到0.20%時，pH和NH3-N顯著降低，雖然GP24有增加的趨勢，但各組間無顯著差異(P>0.05)。添加鞣花酸后，甲烷濃度顯著降低，與對照組相比，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組分別降低33.03%、31.99%和24.61%(P<0.05)。隨著鞣花酸水平的增加，pH和甲烷濃度呈顯著的線性和二次降低(P<0.05)，并線性升高GP24，降低NH3-N濃度(P<0.05)。

添加丁香酸對pH無顯著影響(P>0.05)，NH3-N顯著降低(P<0.05)，而GP24和GP48顯著升高(P<0.05)。與對照組相比，當丁香酸添加水平達到0.10%和0.20%時，甲烷濃度提高了32.23%和31.40%(P<0.05)。隨著丁香酸水平的增加，NH3-N濃度呈顯著的線性和二次降低(P<0.05)，GP24、GP48和甲烷濃度線性升高(P<0.05)。

添加蘆丁對甲烷無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，添加0.20%的蘆丁使pH顯著下降、GP24和GP48顯著升高(P<0.05)；添加0.05%～0.20%的蘆丁使NH3-N顯著下降(P<0.05)。隨著蘆丁水平的增加，線性和二次降低pH(P<0.05)，升高GP24和GP48(P<0.05)，NH3-N濃度呈顯著的線性降低(P<0.05)。

2.2 不同水平植物酚酸對體外發酵后VFA的影響

由表2可知，添加單寧酸對乙酸、丙酸和TVFA(總揮發性脂肪酸，total volatile fatty acids)無顯著影響(P>0.05)，隨著單寧酸水平的增加，乙酸呈線性增加趨勢(P=0.083)，異丁酸和異戊酸呈顯著的線性和二次降低(P<0.05)，丁酸和戊酸線性降低(P<0.05)，而乙丙比呈線性升高(P<0.05)。

對羥基苯甲酸對瘤胃體外發酵揮發性脂肪酸的影響較小，當添加水平為0.10%時，乙酸顯著低于對照組(Ⅰ組)和0.05%組(Ⅱ組)(P<0.05)，其他揮發性脂肪酸、TVFA和乙丙比在各組間均無顯著差異(P>0.05)。隨著對羥基苯甲酸水平的增加，乙酸呈顯著的線性降低(P<0.05)。

添加不同水平鞣花酸對丙酸和異戊酸無顯著影響(P>0.05)，隨著鞣花酸水平的增加，乙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、TVFA和乙丙比呈顯著的線性降低(P<0.05)。當鞣花酸添加水平達到0.10%后，丁酸、戊酸和TVFA均顯著下降；當添加水平達到0.05%后，異丁酸水平和乙丙比均顯著下降(P<0.05)。

除丙酸和TVFA外，添加丁香酸對其他VFA及乙丙比無顯著影響(P>0.05)。添加0.10%的丁香酸后，與0.05%組(Ⅱ組)相比，丙酸顯著增加；另外，第Ⅲ組TVFA較Ⅰ和Ⅱ組也明顯增加(P<0.05)。隨著丁香酸水平的增加，乙酸、TVFA和乙丙比呈顯著的線性增加(P<0.05)。

添加蘆丁對異丁酸和戊酸無顯著影響(P>0.05)，但使其他VFA水平均有顯著升高(P<0.05)。當蘆丁添加劑量達到0.05%后，丙酸、異戊酸和TVFA水平顯著增加；當添加劑量達到0.10%后，乙酸顯著增加而乙丙比顯著下降(P<0.05)；當添加劑量達到0.20%時，丁酸顯著增加(P<0.05)。隨著蘆丁水平的增加，乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸和TVFA呈顯著的線性增加(P<0.05)，而乙丙比線性降低(P<0.05)。

3 討論

3.1 單寧酸對瘤胃發酵及產甲烷的影響

單寧酸(又稱單寧)是一種廣泛存在于植物體內的多元酚類化合物，相對分子量為500～3000 Da，根據其結構特征分為可水解單寧和縮合單寧。無論是水解單寧還是縮合單寧，對瘤胃發酵均具有調控作用。本研究中使用的是可水解單寧，相對分子量為1700 Da。研究表明，添加單寧酸后具有降低氨態氮的作用[7]，在本研究中也得到進一步證實。單寧可通過與飼糧蛋白質形成難以消化的復合物并降低消化酶的活性等方式降低蛋白質在瘤胃中的分解。Min等[8]研究表明，百脈根(Lotuscorniculatus)縮合單寧可降低瘤胃微生物對蛋白質的降解速度，同時抑制部分蛋白質降解菌的生長。這可能是導致氨態氮下降的根本原因。

表2 添加植物酚酸及蘆丁對體外發酵VFA的影響Table 2 Effects of phenolic acids and rutin on VFA in in vitro fermentation (mmol·L-1)

TVFA:Total volatile fatty acids.

通常認為單寧酸對瘤胃微生物的生長有抑制作用。從現有研究可以看出，這種抑制作用與單寧酸的添加水平有密切關系。但Yuliana等[1]在體外培養條件下添加0.5～1.0 mg·mL-1來源于Swieteniamahagony的單寧酸對體外產氣、DMD(degradability of dry matter，干物質降解率)、OMD(degradability of organic matter，有機物降解率)、NH3-N、細菌和原蟲無顯著影響，說明0.5～1.0 mg·mL-1的單寧酸對瘤胃發酵無顯著影響。本研究也發現，添加0.05%～0.10%的單寧酸時，對發酵無顯著影響。當添加水平增加到0.20%時，才顯著增加體外產氣量。這提示，添加低水平單寧并不改變瘤胃發酵，增加單寧添加水平后產氣量的增加與瘤胃微生物區系的變化有關。研究發現，當單寧酸添加水平為底物干物質的1%和2%時可以增加綿羊瘤胃纖維降解菌數量，并降低產甲烷菌的數量[9]。

無論是縮合單寧還是水解單寧均具有降低甲烷產生的作用。然而在本研究中，添加0.05%～0.20%單寧酸并不影響甲烷的產生，這可能與單寧的添加水平、分子結構和相對分子量有關。由于單寧不是一種分子，種類繁多，結構各異，對于瘤胃微生物甲烷排放的作用效果受到單寧來源、形式和水平的影響。研究表明，可水解單寧和縮合單寧混合使用抑制甲烷菌數比單獨使用更有潛力。單寧通過直接抑制甲烷菌或降低原蟲的數量兩個途徑減少甲烷生物合成[10]。瘤胃內產甲烷細菌與原蟲是互利共生的，大部分的產甲烷細菌附著在原蟲表面，將原蟲代謝過程中產生的大量氫氣用于合成甲烷，原蟲的減少導致氫氣產量減少，從而進一步導致甲烷產量下降[11]。另外，單寧的分子量也是影響甲烷產生的因素之一。Saminathan等[12]報道，給反芻動物飼喂從新銀合歡(Leucaenaleucocephala)中提取的不同分子質量的縮合丹寧均會降低甲烷產量，并且分子質量越大，影響越顯著。還有，單寧的結構也影響其抑制甲烷的能力，如白堅木(Loxopterygiumlorentii)、橡豌、葡萄籽來源的單寧顯著降低甲烷生成，而來源于秘魯樹莢、板栗、綠茶的單寧對瘤胃甲烷生成影響不顯著[13]。有關單寧結構與抑制甲烷生成的活力之間的關系目前還不清楚。

3.2 對羥基苯甲酸對瘤胃發酵及產甲烷的影響

張輝[14]發現，體外培養條件下，當對羥基苯甲酸添加水平為30～120 mg·g-1底物時，隨著添加水平的增加，72 h累計產氣量有線性降低的趨勢，產氣速度顯著下降。然而在本研究中，添加對羥基苯甲酸后GP24和GP48均顯著增加。產氣量的變化與瘤胃微生物，特別是纖維降解菌降解纖維的能力有關。Borneman等[15]發現，添加5和10 mmol·L-1對羥基苯甲酸可以刺激纖維分解菌生長及生黃瘤胃球菌降解纖維的作用。但是Chesson等[16]發現，5 mmol·L-1以上對羥基苯甲酸使產琥珀酸絲狀桿菌和生黃瘤胃球菌的纖維消化程度或纖維降解活性持續降低，而白色瘤胃球菌不受其影響。由此可見，對羥基苯甲酸對瘤胃微生物的影響還需進一步研究。

與其他添加水平相比，對羥基苯甲酸添加水平為60 mg·g-1時氨態氮顯著下降；總揮發性脂肪酸濃度隨對羥基苯甲酸濃度的增加呈顯著線性下降[14]。在本研究中，當對羥基苯甲酸添加水平達到0.10%時，氨態氮顯著下降，乙酸明顯下降，但總揮發性脂肪酸并無顯著差異。對羥基苯甲酸對蛋白質降解的影響可能與其他植物酚類化合物相似，抑制了蛋白質在瘤胃中的降解，致使氨態氮水平降低。

到目前為止，尚未見有關對羥基苯甲酸對瘤胃產甲烷菌影響的報道。在本研究中，添加對羥基苯甲酸對混合瘤胃微生物的甲烷產生無顯著影響。因此推測，對羥基苯甲酸對瘤胃產甲烷菌無抑制作用。

3.3 鞣花酸對瘤胃發酵及產甲烷的影響

研究發現，鞣花酸具有抑制瘤胃真菌Neocallimastixfrontalis纖維素酶活性的作用，并且其作用明顯強于單寧[17]。鞣花酸對瘤胃中其他酶類活性有何影響，尚不清楚。在本研究中，當鞣花酸添加水平達到0.20%時，發酵終點pH、氨態氮、揮發性脂肪酸均下降；特別是添加鞣花酸后，甲烷下降明顯。這可能與鞣花酸的抑菌作用有關。

3.4 丁香酸對瘤胃發酵及產甲烷的影響

Borneman等[15]認為，在純培養條件下添加5和10 mmol·L-1丁香酸可提高纖維素降解菌和半纖維素降解菌的生長，在添加量達10 mmol·L-1時顯著提高生黃瘤胃球菌降解濾紙的能力；但是當以純纖維素為底物時，在混合瘤胃微生物中添加10 mmol·L-1的丁香酸后，纖維素的干物質降解率反而顯著下降。這可能是由于丁香酸被混合瘤胃微生物中的非纖維降解菌代謝而未能發揮期促生長作用[15]。當以草原干草為底物，1.0 mmol·L-1對羥基苯甲酸與酵母可提高瘤胃微生物體外產氣和底物干物質降解率，而丁香酸僅提高體外產氣量，對底物干物質降解率無顯著影響[18]。在本試驗中，底物精粗比為65∶35，當丁香酸添加水平達到0.10%時，GP24、GP48、甲烷、總揮發性脂肪酸和丙酸均有不同程度增加。這表明，丁香酸對體外發酵的影響可能與底物類型有關。

3.5 蘆丁對瘤胃發酵及產甲烷的影響

蘆丁屬多酚黃酮類化合物，Oskoueian等[4]在粗料型(6∶4)底物中添加4.5%(底物干物質基礎)的蘆丁后顯著抑制甲烷產生，但對產甲烷菌數量無顯著影響。甲烷的降低可能與瘤胃微生物區系的變化及碳水化合物水解酶活性降低有關[4]。然而，在本研究中，向精料型底物添加0.05%～0.20%的蘆丁并未降低甲烷的產生，與上述研究結論截然相反。另外，本研究還發現，添加蘆丁可顯著增加揮發性脂肪酸濃度，特別是在高濃度時，作用更為明顯。郭旭東等[19]報道，在瘤胃液中添加蘆丁可提高瘤胃內容物碳水化合物水解酶活性，這有利于加快纖維性物質在瘤胃內的降解，提高粗纖維的利用率。Cui等[20]在奶牛飼糧中添加3.0 mg·kg-1飼糧的蘆丁，瘤胃pH有降低的趨勢，氨態氮明顯降低，TVFA和微生物總蛋白質明顯升高。本研究結果與此基本一致。

4 結論

在體外發酵高精料底物條件下，添加一定水平的酚酸和蘆丁能降低NH3-N濃度，增加產氣量；丁香酸和蘆丁可增加總揮發性脂肪酸水平，而鞣花酸降低總揮發性脂肪酸水平；僅鞣花酸能抑制甲烷產生，而丁香酸提高甲烷的產生。