牦牛病毒性腹瀉病診斷與病毒分離鑒定

樊鳳霞，駱正杰

（1.青海省大通種牛場，西寧 810102；2.國家肉牛體系大通綜合試驗(yàn)站，西寧 810102）

0 引言

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉病毒感染而引起的一種以腹瀉、繁殖障礙及免疫障礙為主要臨床特征的急性、熱性、高度接觸性、傳染性疾病。由于牛病毒性腹瀉會(huì)嚴(yán)重影響牛的機(jī)體免疫功能，造成牛出現(xiàn)免疫抑制和持續(xù)性感染，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病毒分離鑒定主要選擇由大通回族自治縣實(shí)驗(yàn)室保存的牦牛腎傳代細(xì)胞，牛病毒性腹瀉病毒陽性血清、陰性血清、牛病毒性腹瀉間接免疫熒光檢測(cè)試劑盒3種物品均購自于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 臨床診斷

結(jié)合大通縣某養(yǎng)殖場的實(shí)際發(fā)病情況，對(duì)該養(yǎng)殖場發(fā)病牛的臨床癥狀進(jìn)行認(rèn)真仔細(xì)地觀察，結(jié)合養(yǎng)殖場該病的流行情況和患病牛的臨床表現(xiàn)，對(duì)該病做出初步診斷。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

采集養(yǎng)殖場某患病牛的鼻腔粘液和糞便，作為臨床實(shí)驗(yàn)室診斷病料，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 病毒分離培養(yǎng)與細(xì)胞病變觀察

將從患病養(yǎng)殖場帶回的鼻腔粘液和糞便分別用經(jīng)過滅菌的生理鹽水充分進(jìn)行5倍稀釋，使用0.45 um的濾膜進(jìn)行充分過濾后，除去表面細(xì)菌，取0.5 mL濾液接種到牛腎傳代單層細(xì)胞中，在5%的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞的病變情況，連續(xù)培養(yǎng)第5天后，收獲病毒，盲傳10代。

1.3.3 病毒毒價(jià)測(cè)定

將盲傳10代后分離得到的毒株分別進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍稀釋，將各稀釋病毒分別接種到96種細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的牛腎傳代單層細(xì)胞中，每個(gè)孔接種0.1 mL，每個(gè)稀釋度分別接種8個(gè)孔，連續(xù)培養(yǎng)5 d后，根據(jù)各個(gè)稀釋度細(xì)胞病變孔數(shù)計(jì)算分離得到的病毒對(duì)牛腎傳代細(xì)胞的半數(shù)感染量。

1.3.4 病毒中和試驗(yàn)

將盲傳10代分離得到的病毒與等量體積的牛病毒性腹瀉標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清在室溫環(huán)境下中和1 h后，分別接種到牛腎傳代單層細(xì)胞中，將細(xì)胞放置于5%的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，每天觀察細(xì)胞的病變情況，觀察分離得到的病毒分別與陽性血清、陰性血清中和作用后是否能引起細(xì)胞發(fā)生特異性病變，確定陽性血清和陰性血清是否對(duì)分離得到的病毒具有中和作用。

1.3.5 間接免疫熒光試驗(yàn)

將盲傳10代分離得到的病毒接種到牛腎傳代單層細(xì)胞中，并按照牛病毒性腹瀉間接免疫熒光檢測(cè)試劑盒的說明書嚴(yán)格操作，確保整個(gè)操作正確[1]。

2 臨床診斷與試驗(yàn)結(jié)果

2.1 臨床診斷

青海省大通回族自治縣某養(yǎng)殖場，共飼養(yǎng)牦牛100余頭，2017年4月13日，養(yǎng)殖場中的2頭2月齡犢牛，突然出現(xiàn)發(fā)病狀況，發(fā)病初期表現(xiàn)為體溫突然升高到42 ℃以上，精神萎靡不振，采食停止，隨后從鼻腔和眼睛中分泌出漿液性和膿性內(nèi)容物，鼻鏡糜爛，檢查口腔黏膜存在潰瘍病變，從口腔中呼出惡臭氣體。隨后出現(xiàn)水樣腹瀉癥狀，開始時(shí)糞便中會(huì)夾雜大量粘液和小氣泡，發(fā)病中后期糞便中夾雜大量血液和腸粘膜脫落物，身體逐漸消瘦，病程持續(xù)3～4周。在整個(gè)發(fā)病期間，嘗試使用多種抗生素結(jié)合治療，均未取得明顯效果，根據(jù)臨床癥狀，初步懷疑是牛病毒性腹瀉[2]。

2.2 病毒分離培養(yǎng)與細(xì)胞病變觀察

將采集到的病料妥善處理接種到牛腎傳代單層細(xì)胞中后，盲傳到第7代，開始陸續(xù)出現(xiàn)病變明顯的細(xì)胞，主要表現(xiàn)為接種毒株后72 h內(nèi)，細(xì)胞逐漸萎縮，拉網(wǎng)聚集脫落。病毒盲傳到第10代后，收獲病毒，－80 ℃環(huán)境保存。

2.3 分離毒株毒價(jià)鑒定

將盲傳到第10代獲得的毒株按照上述要求進(jìn)行充分稀釋后，將各個(gè)稀釋度分別接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的牛腎傳代單層細(xì)胞中，細(xì)胞病變情況如表1所示。按照Reed-Muench法計(jì)算毒株的毒價(jià)為10-5.19/0.1 mL。

表1 分離毒株毒價(jià)鑒定記錄

2.4 病毒中和試驗(yàn)

盲傳到第10代獲得的毒株和牛病毒性腹瀉陽性血清作用后接種的牛腎傳代單層細(xì)胞未出現(xiàn)任何細(xì)胞病變情況，與牛病毒性腹瀉陰性血清作用后接種的牛腎傳代單層細(xì)胞，細(xì)胞逐步出現(xiàn)萎縮、拉網(wǎng)、聚集、脫落等典型的細(xì)胞病變。因此，可以確定牛病毒性腹瀉陽性血清對(duì)分離得到的病毒的增殖具有明顯的中和作用。

2.5 熒光免疫試驗(yàn)

盲傳到第10代獲得的毒株的牛腎傳代單層細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)了明顯的特異性綠色熒光病變，而正常的細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)任何特異性綠色熒光變化。因此，可以確診分離的病毒為牛病毒性腹瀉病毒[3]。

3 結(jié)論

牛病毒性腹瀉病毒在臨床和病理變化上與牛冠狀病毒、輪狀病毒較為相似。結(jié)合患病牛流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀和病理學(xué)變化，可以對(duì)病情做出初步診斷，但要進(jìn)一步確診，還需要借助實(shí)驗(yàn)室診斷方法明確病原。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室診斷和臨床診斷最終確診為牛病毒性腹瀉病毒感染。通過采集發(fā)病養(yǎng)殖場患病牛的新鮮病料，帶回實(shí)驗(yàn)室后接種到牛腎傳代單層細(xì)胞中，盲傳10代后分離得到了牛病毒性腹瀉病毒。

在進(jìn)行病毒檢測(cè)中，病毒中和試驗(yàn)一直是應(yīng)用較為廣泛的檢測(cè)方法。間接免疫熒光試驗(yàn)法是現(xiàn)行獸醫(yī)典中規(guī)定的獸用生物制品檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒外源感染的主要方法。隨著我國科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，用于檢測(cè)該種病毒的試劑盒已經(jīng)存在，并且已經(jīng)成熟應(yīng)用。試劑盒檢測(cè)牛病毒性腹瀉具有操作簡單、檢測(cè)速度快、干擾小的特點(diǎn)，能快速鑒定牛病毒性腹瀉病毒。因此，此次研究主要采用綜合試驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn)的方法對(duì)病毒進(jìn)行鑒定，結(jié)果可靠穩(wěn)定。通過分離養(yǎng)殖場的致病原，明確致病原類型，為該養(yǎng)殖場今后疾病的防控提供有效參考。