偽狂犬實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

劉國(guó)英，商曉桂，范秀麗，張貴剛，郝鵬，閆聰，韓志玲

（金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010030）

0 引言

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（PseudorabiesVirus，PRV）引起的B類傳染病[1]（OIE認(rèn)定），分布廣泛，危害嚴(yán)重，可以感染不同年齡段的豬，但以妊娠母豬和哺乳仔豬感染最為嚴(yán)重。該病導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎；哺乳仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹、衰竭死亡[2]，死亡率幾乎高達(dá)100%。目前PR已成為對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)危害最大的傳染病之一，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

偽狂犬病毒又稱豬皰疹病毒Ⅰ型，屬于皰疹病毒科中的α皰疹病毒亞科，基因組為雙鏈DNA分子，大小約150 kb，成熟病粒子攜帶50余種蛋白[3]。gE、gG、gI、TK等毒力基因是其復(fù)制非必需基因，其編碼的蛋白為非必需糖蛋白，缺失這些基因后，其復(fù)制擴(kuò)增及抗原性并不受任何影響，但毒力卻降低，其中g(shù)E基因是偽狂犬的主要毒力相關(guān)基因，也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織所規(guī)定基因缺失疫苗的首選缺失基因[4]。目前，歐美等發(fā)達(dá)資本主義國(guó)家應(yīng)用gE基因缺失疫苗及其配套的鑒別診斷方法已實(shí)現(xiàn)了偽狂犬的凈化，中國(guó)也已廣泛使用gE基因缺失弱毒疫苗用于偽狂犬的預(yù)防和控制。gB基因?yàn)閭慰袢《緩?fù)制所必需的基因，在野毒株與基因缺失株中均存在[5]，因此可以通過對(duì)gB基因和gE基因進(jìn)行檢測(cè)，區(qū)分所感染偽狂犬病毒的類型。

目前，國(guó)內(nèi)外常用的實(shí)驗(yàn)室診斷偽狂犬病毒的方法主要包括病毒分離、兔體接種試驗(yàn)、抗體診斷、病原學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷等幾大類，其中分子生物學(xué)診斷中的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)以其快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)成為快速發(fā)展的檢測(cè)手段。該發(fā)明通過建立針對(duì)gB基因和gE基因的雙重?zé)晒舛縋CR方法，能快速鑒別偽狂犬病野毒株與基因缺失株，并對(duì)病毒拷貝數(shù)進(jìn)行精確定量[6-7]，為偽狂犬病毒的快速診斷提供科學(xué)依據(jù)，也對(duì)偽狂犬疫苗的生產(chǎn)具有指導(dǎo)作用，同時(shí)對(duì)于疫病的控制和凈化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

偽狂犬病毒樣品為實(shí)驗(yàn)室的偽狂犬弱毒株與強(qiáng)毒株細(xì)胞培養(yǎng)物、偽狂犬弱毒株細(xì)胞培養(yǎng)物濃縮樣品、病料等；陽性對(duì)照為偽狂犬弱毒株細(xì)胞培養(yǎng)物。

1.1.2 試劑

PCR 4-TOPO載體、Easy Dilution、X-gal、IPTG、Amp+、6*loading buffer、T4 DNA連接酶、Premix Ex Taq（Probe qPCR）、DNA Marker、Ex Taq聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNAzol試劑、柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等。

1.1.3 儀器

熒光定量PCR儀、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、電泳系統(tǒng)、凝膠成像儀、核酸蛋白檢測(cè)儀、低溫高速離心機(jī)等。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

1.2.1 引物與探針設(shè)計(jì)

對(duì)GenBank中的偽狂犬病病毒gB基因和gE基因的DNA序列進(jìn)行比對(duì)，選取gB、gE基因高度保守且具有特異性的序列，設(shè)計(jì)Taqman探針和引物。gB基因上游引物為：GGATCTCGCTGTAGTCCAGGAG；下游引物為：GAGGTGCCCGAGACGATCAG；探針序列為：（FAM）TGACCCTGAACCTGACGCTGCTGGA（TAMRA），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為133 bp。gE基因上游引物為：CTCGTGATGACCCACAAAGG；下游引物為：CTTGATGACCGTGACGTACTC；探針序列為：（ROX）CGCCACCTGGGACTACACGCT（BHQ2），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為84 bp。引物和探針序列由TaKaLa公司合成。

1.2.2 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

在偽狂犬病病毒gB基因和gE基因的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)包含熒光定量PCR擴(kuò)增片段的引物，用于標(biāo)準(zhǔn)品制備，gB基因上游引物為：GGACAGGAAGGACACCAT；下游引物為：CTACGAGGACTACAACTACG，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為364 bp。gE基因上游引物為：GACGACGATGACCTCAA；下游引物為：CTCCTTGATGACCGTGAC，擴(kuò)增長(zhǎng)度為990 bp。引物序列均由TaKaLa公司合成。將純化回收的含有偽狂犬病毒gB基因和gE基因目的片段分別克隆至pGEM-T載體中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，用Nanodrop測(cè)定濃度，計(jì)算gB基因和gE基因標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)分別為：2.7×1010copies/μL，2.1×1010copies/μL，按照比例用無酶水對(duì)DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，使拷貝數(shù)為1×1010copies/μL，按每管20 μL進(jìn)行分裝。

1.2.3 雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的建立

雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)的體系為：Premix Ex Taq（Probe qPCR）12.5 μL，gB基因和gE基因上下游引物各0.5 μL，探針各1 μL，DNA模板2 μL，無酶水6.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，45個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。

1.2.4 雙重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取gB基因和gE基因標(biāo)準(zhǔn)品用無酶水做10倍梯度稀釋，使模板濃度為1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL，每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)，以各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度log值（X軸）對(duì)其相應(yīng)CT值（Y軸）作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 靈敏性驗(yàn)證

以偽狂犬gB基因和gE基因拷貝數(shù)為1×101～1×108copies/μL的DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，通過雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)拷貝數(shù)梯度的擴(kuò)增情況，并將熒光定量產(chǎn)物進(jìn)行電泳，以比較熒光定量方法和普通PCR檢測(cè)方法的靈敏性。

1.2.6 重復(fù)性驗(yàn)證

（1）組內(nèi)重復(fù)性驗(yàn)證。

隨機(jī)選取6支偽狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)物，用DNAzol提取DNA后，利用建立好的雙重?zé)晒舛繖z測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，每個(gè)樣品各做5次重復(fù)。對(duì)各樣品的CT值計(jì)算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差，驗(yàn)證組內(nèi)重復(fù)性。

（2）組間重復(fù)性驗(yàn)證。

隨機(jī)選取10支偽狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)物，用DNAzol提取DNA后，利用建立好的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別進(jìn)行5次熒光定量PCR檢測(cè)，每次每個(gè)樣品各做2個(gè)重復(fù)，對(duì)5次試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，驗(yàn)證建立體系的組內(nèi)重復(fù)性。

1.2.7 特異性驗(yàn)證

分別用DNAzol對(duì)偽狂犬、豬瘟、BVD、IBR、羊口瘡等病毒培養(yǎng)物提取DNA，以水為陰性對(duì)照，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，驗(yàn)證所建立的偽狂犬雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系是否具有特異性。

1.2.8 臨床樣品檢測(cè)

利用已建立的偽狂犬雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系對(duì)12份臨床疑似血清病料進(jìn)行檢測(cè)，以水為陰性對(duì)照，以滅活的豬偽狂犬病野毒株細(xì)胞培養(yǎng)物和基因缺失株細(xì)胞培養(yǎng)物為陽性對(duì)照，對(duì)試驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品用DNAzol提取核酸DNA后進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，樣品及標(biāo)準(zhǔn)品均各做2個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 雙重?zé)晒舛繕?biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對(duì)拷貝數(shù)均為1×101～1×108copies/μL的偽狂犬病毒gB和gE基因標(biāo)準(zhǔn)品做熒光定量PCR擴(kuò)增，gB擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見圖1、圖2；gE擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見圖3、圖4。由圖1、圖3可知2種標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線均為平滑的“S”形曲線，各稀釋梯度之間相差約3個(gè)CT值，且gB基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=－0.998x+37.806，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，gE基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=－0.993x+42.716，相關(guān)系數(shù)R2=0.993，說明擴(kuò)增體系較好，雙重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建成功。

圖1 gB擴(kuò)增曲線

圖2 gB標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 gE擴(kuò)增曲線

圖4 gE標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 靈敏性驗(yàn)證

由圖5電泳檢測(cè)可知，雙重?zé)晒舛縋CR體系可以檢測(cè)到病毒的最小拷貝數(shù)為102/μL，而普通PCR方法電泳檢測(cè)僅能檢測(cè)到拷貝數(shù)為103/μL的結(jié)果，說明熒光定量方法的靈敏度較高。

圖5 不同拷貝數(shù)熒光定量結(jié)果電泳檢測(cè)

2.3 重復(fù)性驗(yàn)證

2.3.1 組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)選取6支偽狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，每個(gè)樣品各做5個(gè)重復(fù)。計(jì)算各樣品CT值的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差，如表1所示，各樣品的5次重復(fù)性試驗(yàn)之間的離散度較小，重復(fù)性好，滿足試驗(yàn)要求。

表1 組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 組間重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)選取10支偽狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)物，利用建立好的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別進(jìn)行5次熒光定量PCR檢測(cè)，每次每個(gè)樣品各做2個(gè)重復(fù)，對(duì)5次試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見表2，各組樣品離散度較小，說明重復(fù)性較好。

表2 組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 特異性驗(yàn)證

利用雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法對(duì)偽狂犬、豬瘟、BVD、IBR、羊口瘡等病毒進(jìn)行檢測(cè)，由擴(kuò)增曲線可知，僅偽狂犬病毒有雙重?zé)晒馇€，其余病毒CT值均大于38，判定結(jié)果為陰性，說明所建立的雙重?zé)晒舛縋CR體系特異性好，可以用于病毒鑒定，見圖6。

圖6 雙重?zé)晒舛縋CR特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 雙重?zé)晒舛縋CR對(duì)樣品的檢測(cè)

所檢測(cè)的12份疑似血清中有2份血清判定為陰性（不含gB基因和gE基因，即未感染豬偽狂犬病毒），10份血清判定為陽性（感染豬偽狂犬病毒），其中4份血清為豬偽狂犬病野毒株感染（含gB基因和gE基因），6份血清為豬偽狂犬病基因缺失株感染（僅含gB基因，缺失gE基因）。檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 疑似血清病料的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)束語

目前國(guó)際上對(duì)偽狂犬病的防治措施以疫苗免疫為主，但常規(guī)的血清學(xué)方法無法區(qū)分野毒感染和疫苗免疫動(dòng)物[8]，對(duì)偽狂犬病的防治及后期的凈化帶來不便。該研究建立了針對(duì)偽狂犬病毒gB基因和gE基因的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，能快速鑒別偽狂犬病野毒株（同時(shí)含有g(shù)B基因和gE基因）與基因缺失株（僅含有g(shù)B基因），并且靈敏度高，可以檢測(cè)到拷貝數(shù)為102/μL的病毒粒子。同時(shí)，檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，可以在3～4 h內(nèi)對(duì)疑似樣本作出診斷，且不會(huì)受到其他病原干擾。該研究建立的方法為豬偽狂犬病毒的早期診斷、感染毒株鑒定及流行病學(xué)調(diào)查提供了一種重要的技術(shù)手段，對(duì)于防治該種疾病具有重要意義。