有氧運動及膳食干預對胰島素抵抗大鼠心肌過氧化物酶體增殖物激活受體γ的影響

吳菊花 劉無逸 (廣西科技大學，廣西 柳州 545006)

胰島素抵抗與2型糖尿病發生發展緊密相聯，可使機體產生心肌梗死、糖尿病性心肌病等疾病，其過程中易產生心肌脂質代謝紊亂。有研究表明，心肌細胞脂質代謝及能量代謝紊亂可能導致心肌產生多種疾病〔1，2〕。而過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)在調節脂肪酸氧化酶活性、促進脂代謝、改善血脂及抗氧化、抗炎、抗凋亡等方面作用顯著，尤其在脂代謝和糖代謝方面扮演重要角色，已引起眾多學者關注〔3，4〕。PPARγ是PPARs亞型之一，是脂肪細胞分化的關鍵調控因子之一，可增加脂肪細胞數量，促進脂肪細胞三酰甘油合成，有效調劑脂質代謝過程，經激動劑激活后也可增強胰島素敏感性。本實驗旨在觀察有氧運動及膳食干預下，胰島素抵抗大鼠心肌PPARγ表達是否發生變化，進而確定有氧運動及膳食干預對胰島素抵抗大鼠心肌脂質代謝是否產生影響。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑及儀器 PPARγ抗體(SC-1984，美國Santa Cruz公司);山羊抗兔 IgG/辣根過氧化物酶(HRP)(碧云天生物技術研究所);β-actin(碧云天生物技術研究所);RIPA蛋白裂解液(P0013B，碧云天生物技術研究所);DSPT-202動物跑臺(杭州段氏制造);電泳儀(美國Hoefer公司);轉膜儀(北京百晶生物技術限公司)等。所有實驗儀器及實驗流程在上海體育學院運動健身科技省部共建教育部重點實驗室運動分子中心操作進行。

1.2 實驗動物及分組 選用清潔級健康雄性SD大鼠215只，7周齡，體重206～257 g。大鼠購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，批準號為〔準 SCXK(滬)2003-0002〕。清潔級飼養室:5只/籠進行分組，光照12 h，天黑前投食，自由飲水;環境溫度為22±2℃，相對濕度55.6%±4%。大鼠基礎飼料適應性喂養1 w后，分為安靜對照組(CON)15只，胰島素抵抗模型組(MIR)200只。造膜成功后，MIR組分為高脂膳食安靜對照組(DIO)15只、高脂膳食運動組(DE)15只、正常膳食安靜對照組(NOR)15只、正常膳食運動組(NE)15只。CON組無任何干預;DIO組僅繼續高脂喂養;DE組繼續高脂飼料喂養8 w，同時進行中等強度跑臺運動;NOR組改為基礎飼料喂養;NE組改為基礎飼料喂養8 w，同時進行中等強度跑臺運動。

1.3 模型建立及運動方案 基礎飼料:蛋白質22.0%，脂肪5.2%，碳水化合物52.0%，其他20.8%。高脂飼料:在上述飼料基礎上，添加 10.0%豬油，15.0%蔗糖，0.2%膽固醇，0.2%蛋黃?；A飼料及高脂飼料由中國科學院上海斯萊克實驗動物有限公司提供。

1.3.1 MIR建立 CON和MIR組不限食量飼養。CON組基礎飼料喂養8 w;MIR組高脂飼料喂養8 w，隨后進行口服糖耐量試驗:大鼠空腹12 h，眼眶靜脈取血以利舒坦血糖儀及試紙測即時空腹血糖(FBG)，同時留取空腹靜脈血 0．5 ml。用 50%葡萄糖灌胃(2 g/kg)。于糖負荷后15、30、60和 120 min測即時血糖，并于每一時間點取血 0．5 ml，37℃ 靜置 10～20 min，3 000 r/min 離心 5min，分離血清，－20℃保存，待測，并根據公式，計算葡萄糖曲線下面積(AUCg)和胰島素曲線下面積(AUCi)。AUCg=1/2×(0 min+15 min)×0．25+1/2×(15 min+30 min)×0．25+1/2×(60 min+30 min)×0．5+1/2×(60 min+120 min)×1;AUCi=1/2×(0 min+15 min)×0．25+1/2×(15 min+30 min)×0．25+1/2×(60 min+30 min)×0．5+1/2×(60 min+120 min)×1。檢驗建模是否成功，測定FBG和空腹胰島素(FIN)，并計算胰島素敏感指數(ISI)。MIR組ISI顯著低于CON組，表明模型建立成功。ISI=In〔1/(FBS×FIN)〕〔5〕。胰島素為目前已知的唯一的降糖激素，其降糖作用發揮主要依賴于機體胰島素敏感性達到某一穩定的平衡，血漿胰島素及其組織敏感性都與血糖呈負相關，該公式可用于同一種群。模型建成后，將MIR組按體重排序，選取上游30%大鼠進行后續研究〔6〕。

1.3.2 運動方案 開始時連續運動9 d，第1天跑速10 m/min，持續時間 20 min，以后隔日增加速度2 m/min，持續時間增加 10 min，第 9天起跑速達18 m/min，持續時間達60 min，跑臺坡度為5%，維持此強度，每周運動5 d，持續4 w;在第5～8周將跑速調節到 20 m/min，其余和前 4 w 相同〔7〕。

1.4 取材及實驗方法 末次運動訓練后，于第2天早晨用水合氯醛腹腔麻醉各組大鼠，取心臟，置于－80℃冰箱，冰凍處理。Western印跡半定量測定 PPARγ表達。

1.5 Western印跡 取200 mg心肌，加入1 ml RIPA裂解液和蛋白酶及磷酸酶抑制劑，置于冰上，進行玻璃勻漿器研磨;4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，保存于－20℃冰箱，待用。取適量蛋白與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(2×)，1∶1混勻，沸水煮 6～8 min，冷卻后保存于－20℃。取蛋白樣品60 μg上樣，60 V電壓，在5%濃縮膠中濃縮約1.5 h;80 V電壓，在12%分離膠中分離約2.5 h;以120 V電壓轉膜約2 h。封閉:5%脫脂奶粉中4℃過夜。將NC膜置于一抗(PPARγ抗體:1∶500;β-actin:1∶1 000)中，4℃過夜;次日 TBST 洗滌 5×5 min，敷二抗(山羊抗兔IgG/HRP:1∶1 000)。室溫下搖床2 h;電化學發光法(ECL)發光，暗室顯影，灰度分析。

1.6 數據處理 Quantity One軟件讀取蛋白條帶的積分灰度值，Western印跡結果用目的蛋白積分灰度值與內參蛋白積分灰度值的比值表示。GraphPad Prism 5進行數理統計及圖像生成，采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結果

2.1 胰島素抵抗大鼠建模成功 兩組葡萄糖吸收符合正常代謝過程，即均先升高然后逐漸下降。MIR組血糖上升幅度顯著高于CON組(P＜0.05，P＜0.01)。MIR組血漿胰島素濃度顯著高于CON組(P＜0.01)。CON組與MIR組FBG差異無統計學意義(P＞0.05)，FIN和ISI差異有統計學意義(P＜0.05)。表明建模成功，見表 1，表 2。

表1 CON組和MIR組血糖及胰島素濃度比較(，n=8)

表1 CON組和MIR組血糖及胰島素濃度比較(，n=8)

與 CON 組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01，同表 2

組別 血糖(mmol/L)胰島素(μU/ml)0 min 15 min 30 min 60 min 120 min 0 min 15 min 30 min 60 min 120 min CON 組 5.25±0.11 7.10±1.15 9.27±0.66 9.83±0.81 7.72±0.88 26.76±5.90 58.98±10.63 46.08±12.22 28.26±1.38 26.12±1.58 MIR 組 5.47±0.77 8.94±1.522) 10.48±0.792) 12.10±2.302) 10.36±2.801) 77.56±7.291)127.09±15.511)92.51±6.471) 87.71±8.851)60.74±10.461)

表2 CON組和MIR組FBG、FIN、ISI比較(，n=8)

表2 CON組和MIR組FBG、FIN、ISI比較(，n=8)

組別 n FBG(mmol/L) FIN(μU/ml) ISI AUCg AUCi CON 組 15 5.25±0.15 26.76±6.69 －4.92±0.22 17.14±1.08 69.62±7.66 MIR 組 60 5.47±0.77 77.56±7.291) －6.04±0.191) 21.10±3.422) 172.31±9.132)

2.2 8 w有氧運動及膳食干預后各組大鼠體重的變 化 與CON組相比，NE組NOR組、DIO組和DE組體重均顯著升高(P＜0.05)。與DIO組相比，從第2周干預起，NOR組和DE組體重均顯著降低(P＜0.05);從第3周干預起，NE組顯著性低于DIO組(P＜0.05)。見表3。

表3 8 w有氧運動及膳食干預后大鼠體重的變化(，g，n=8)

表3 8 w有氧運動及膳食干預后大鼠體重的變化(，g，n=8)

與CON組比較:1)P＜0.05;與DIO組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周 第6周 第7周 第8周CON 組 484±28 496±25 504±23 508±24 512±23 515±22 519±22 522±23 NE 組 577±331) 579±321) 571±321)2) 565±301)2) 557±301)2) 552±291)2) 546±291)2) 540±32)NOR 組 575±231) 563±261)2) 558±271)2) 561±241)2) 564±241)2) 566±241)2) 568±271)2) 571±271)2)DIO 組 586±271) 609±221) 623±191) 637±161) 644±151) 653±151) 662±181) 670±171)DE 組 571±291) 574±291)2) 574±281)2) 570±281)2) 568±281)2) 566±261)2) 563±261)2) 561±231)2)

2.3 8 w有氧運動及膳食干預后各組FBG、FIN、ISI比較 5組FBG水平差異無統計學意義(P＞0.05);與CON組相比，DIO組FIN、ISI差異有統計學意義(P＜0.05);與DIO組相比，DE組、NE組和NOR組FIN、ISI差異有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 8 w有氧運動及膳食干預后各組FBG、FIN、ISI表達比較(，n=8)

表4 8 w有氧運動及膳食干預后各組FBG、FIN、ISI表達比較(，n=8)

組別 FBG(mmol/L) FIN(μU/ml) ISI CON 組 5.52±0.50 23.77±5.03 －4.85±0.17 DIO 組 6.06±1.07 131.60±22.881) －6.66±0.271)DE 組 5.62±0.33 41.45±16.402) －5.38±0.472)NOR組 5.54±0.59 29.86±9.722) －5.06±0.402)NE 組 5.56±0.50 35.85±5.222) －5.28±0.202)

2.4 8 w有氧運動及膳食干預后各組心臟重量(HW)和心臟重量指數(HW/BW)比較 NOR組HW明顯高于CON組(P＜0.05);DIO組明顯高于DE組、NE組和NOR組(P＜0.05)，且顯著高于CON組(P＜0.01)。NE組HW/BW顯著高于CON組(P＜0.01)，NOR組和NE組顯著高于DIO組(P＜0.01)。見表5。

2.5 8 w有氧運動及膳食干預后各組心肌PPAR-γ比較 DE組和NE組心肌PPARγ表達量(0.87±0.09、0.88±0.09)顯著高于 CON 組(0.69±0.03，P＜0.05)，DIO組(0.53±0.07)顯著低于CON組(P＜0.05);DE組和NE組顯著性高于DIO組(P＜0.05)。NOR組為0.60±0.09。見圖 1。

表5 8 w有氧運動及膳食干預后各組大鼠HW和HW/BW的變化(，n=8)

表5 8 w有氧運動及膳食干預后各組大鼠HW和HW/BW的變化(，n=8)

與CON 組相比:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與 DIO 組相比:3)P＜0.05

組別 HW(mg) HW/BW(mg/g)CON 1.24±0.08 2.5±0.183 DIO 1.53±0.231) 2.3±0.377 DE 1.24±0.103) 2.5±0.210 NOR 1.39±0.272)3) 2.8±0.7263)NE 1.28±0.123) 2.6±0.2262)3)

3 討論

圖1 心肌PPAR-γ Western印跡

國外研究〔8，9〕表明，高脂飼料誘導所致的肥胖動物模型，符合人類肥胖-胰島素抵抗實際特征，因此本實驗選擇高脂飼料喂養進行胰島素抵抗模型構造。

誘發心臟功能障礙的一個重要因素是心肌胰島素抵抗，心肌胰島素抵抗重要特征之一即心肌細胞內長鏈脂肪酸(LCFA)代謝持續儲積〔10〕，心肌脂代謝出現紊亂。PPARγ表達于心肌細胞中，可調控脂肪細胞分化基因表達，提高細胞質脂解能力，增強脂肪酸向細胞運輸能力，影響細胞對胰島素敏感性，從而影響糖脂代謝，改善胰島素抵抗。Weismann等〔11〕通過敲除Trib3基因大鼠的胰島素抵抗模型，觀察PPARγ對大鼠胰島素敏感性調節狀況，發現大鼠的胰島素敏感性調節主要依靠PPARγ進行，由此可見，PPARγ與胰島素抵抗疾病的發生有重要關系。Sone等〔12〕以138名日本男性為研究對象，根據其是否具有習慣性運動，檢查其血脂變化，發現具有習慣性運動男性的血脂通過PPARγ調節，其血脂具有顯著改善。

適度有氧運動可降低體重，上調脂代謝，減輕胰島素抵抗。Marinho等〔13〕研究發現任何強度有氧運動都可以有效增強小鼠胰島素敏感性。Fedewa等〔14〕對運動是否能夠改善青少年胰島素抵抗，進行Meta分析，結果表明小強度到中等強度的運動可以有效改善其胰島素抵抗狀況。一份2003～2004年度美國國民健康與營養調查報告〔15〕顯示，每天適量的身體運動可有效降低胰島素抵抗程度，對于改善血糖代謝，維持血糖穩定而言，是一個重要的決定因素。Ruschke等〔16〕研究中，對153例患者進行為期4 w的加強性運動，發現患者的PPARγ與胰島素抵抗有相關性，且其 PPARγ mRNA表達量增加，有利于提高患者胰島素敏感性?？傊?，胰島素抵抗患者保持適當的有氧運動即可改善其胰島素抵抗癥狀。

有氧運動除了可改善胰島素抵抗癥狀之外，也有學者從膳食方面對胰島素抵抗的改善進行了研究。研究發現為期6個月的低脂飲食可以有效改善胰島素抵抗現象〔17〕。另外，胰島素抵抗的發生風險與維生素D攝入量呈顯著負相關〔18〕，表明在胰島素抵抗患者的膳食攝入中應增加維生素D的含量。同時，有研究發現增加不飽和脂肪酸和膳食纖維的攝入量，可以大幅度減少青少年日后胰島素抵抗疾病的發生〔19〕。

由于有氧運動和膳食改變可改善胰島素抵抗狀態，研究者將運動和飲食限制結合起來對具有胰島素抵抗的肥胖大鼠進行干預，結果發現兩者結合改善了大鼠肥胖所致的炎癥和胰島素抵抗所致的血管舒張〔20〕。但是關于兩者結合干預胰島素抵抗的研究并不多見，且對有氧運動、膳食改變和有氧運動結合膳食改變這三種干預胰島素抵抗的方式間并未有比較性的研究。本研究結果表明有氧運動結合膳食干預對于大鼠體重控制的效果最為明顯。FIN、ISI和PPARγ都有效反映了機體的糖脂代謝和胰島素抵抗程度。本研究發現，有氧運動和膳食干預均有效地不同程度增加大鼠心肌PPARγ表達，減輕胰島素抵抗，而有氧運動與膳食干預相比，更有效地增加大鼠心肌PPARγ表達，改善了胰島素抵抗，而兩者疊加進行干預，則效果更顯著。

綜上，PPARγ在體內糖脂代謝中作用復雜，有氧運動或(和)膳食干預如何影響PPARγ表達還需進一步研究。目前針對PPARγ如何改善胰島素抵抗中的脂質代謝的機制仍存在一定爭議，仍需大量實驗研究證實。