多花黃精組培育苗技術

陳龍勝， 董先茹， 蔡群興， 劉玉軍， 陳瑞瑞

(1.安徽省科學技術研究院，安徽合肥 230031； 2.安徽省應用技術研究院，安徽合肥 230088； 3.安徽農業大學，安徽合肥 230036)

多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)別稱九華黃精，系百合科黃精屬多年生草本植物。黃精以根狀莖入藥，集藥用、食用、觀賞和美容價值于一身，在研制新藥和開發保健品方面具有廣闊應用前景[1-3]。多花黃精喜生于緩坡、雜草叢或林下蔭地，種質資源分布較廣。

九華山地區所產多花黃精品質上佳，有著悠久的歷史文化淵源，“九華黃精”已經成為國家地理標志產品。隨著九華山旅游產業的快速發展，野生黃精因市場需求量增加而遭大量采挖，使其野生種質資源愈來愈少，生態平衡受到破壞。目前，當地人工栽培主要采用根莖進行無性繁殖，但該方法繁殖系數低，根莖用種量大，既提高了成本，又限制了多花黃精的種植規模，且多代根莖繁殖后會造成病毒的積累和種質的退化[4]。因而，利用植物組織培養技術建立多花黃精快速繁殖體系是生產黃精種苗的有效途徑。目前，多華黃精的研究主要集中在其成分測定[5-6]、藥理作用[7]、育苗技術[8-11]以及傳統人工栽培[12]等方面，而由于種子具有嚴重的休眠特性，關于種子組織培養方面的研究內容鮮見報道。本試驗主要研究打破黃精種子休眠技術，并通過快繁培養擴大種苗規模，進一步進行生根培養誘導生根，最后煉苗完成植株再生全過程，旨在為多花黃精種苗工廠化生產提供科學依據，實現短期內繁殖大量種苗的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年10月13日在安徽省青陽縣陵陽鎮分流村黃精種植試驗基地，選取生長健壯、無病蟲害的優質黃精單株，收集成熟的果實。果實使用塑料袋密封發酵10 d后，人工搓洗出種子(圖1)。

1.2 方法

1.2.1 多花黃精種子休眠的打破 將搓洗后得到的多花黃精種子，用多菌靈浸泡消毒8 h后，再用不同的激素組合浸泡 2 h 打破休眠，設以下處理：(1)300 mg/L GA3+300 mg/L KT；(2)300 mg/L GA3+300 mg/L ZT；(3)300 mg/L GA3+300 mg/L 2-ip；(4)300 mg/L GA3+300 mg/L BA，另設1組無菌去離子水處理組為對照，處理完成后，按種子河沙體積比1 ∶3的比例混勻后，調節濕度至30%，25 ℃條件下催芽，每個處理100粒種子，3次重復，45 d后開始統計種子發芽率和污染率。

1.2.2 組培種芽消毒 催芽完成后，選取生長基本一致、芽長約0.5 cm的多花黃精種芽(圖2)作為外植體，使用洗潔精溶液淘洗3遍，流水沖洗4 h，無菌條件下分別使用以下方法做消毒處理：(1)75%乙醇30 s+0.1%氯化汞5 min；(2)75%乙醇 30 s+0.1%氯化汞10 min；(3)75%乙醇30 s+0.1%氯化汞 15 min；(4)75%乙醇+0.1%氯化汞5 min+第2天重復處理1次；(5)75%乙醇+0.1%氯化汞10 min+第2天重復處理1次。消毒完成后，無菌水洗5遍。接種于MS培養基中，每個處理100粒種子，3次重復，于溫度25 ℃、16 h光照、光照度1 200 lx條件下培養，7 d后統計污染率，同時進一步觀察種芽生長情況(圖3)。

1.2.3 快繁培養 將多花黃精芽在無菌條件下接種入各預先配制的快繁培養基中，快繁培養基設以下處理：(1)MS+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L NAA；(2)MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA；(3)MS+2 mg/L BA+0.5 mg/L NAA；(4)MS+0.2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA；(5)MS+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA；(6)MS+1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA；(7)MS+0.2 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA；(8)MS+0.5 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA；(9)MS+1 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA；接種完成后，放入溫度25 ℃、16 h光照、光照度1 200 lx條件下培養，45 d后統計觀察快繁情況(圖4)。

1.2.4 生根培養 將快繁后的無菌苗分株，轉接入預先配制的生根培養基中，培養基設以下處理：(1)MS+1 mg/L NAA+0.1% AC；(2)MS+2 mg/L NAA+0.1% AC；(3)MS+3 mg/L NAA+0.1% AC； (4)MS+1 mg/L IBA+0.1% AC；(5)MS+2 mg/L IBA+0.1% AC；(6)MS+3 mg/L IBA+0.1% AC；(7)MS+1 mg/L BA+2 mg/L NAA+0.1% AC；(8)MS+1 mg/L BA+2 mg/L IBA+0.1% AC；放入溫度 25 ℃、16 h光照、光照度1 200 lx條件下培養，45 d后統計觀察生根情況(圖5)。

1.2.5 煉苗 待無菌苗在瓶中完成生根，打開瓶蓋3 d，使無菌苗初步適應外界環境，使用營養土、蛭石、沙不同的比例配制生根移栽基質，將無菌苗洗凈移栽入基質中，每天噴水，保持足夠濕度，45 d后統計種苗存活情況(圖5)。

2 結果與分析

2.1 不同激素處理對種子休眠的影響

研究發現，在不使用激素的情況下，多花黃精種子的發芽率很低，只有約9.3%，且發芽時間長，發芽不整齊(表1)。這說明多花黃精種子具有較強的休眠性，因而自然條件下多花黃精種子無法用于大量繁殖種苗；不同濃度的激素結合GA3可以有效打破多花黃精種子的休眠，最合適的濃度為300 mg/L GA3+300 mg/L 2-ip的激素處理，其發芽率達到91.7%，基本完成了對種子休眠的打破(表1)。

2.2 種芽消毒方式

研究發現，氯化汞處理時間從5 min提高到15 min，染菌率從68.6%降低到9.3%，但是對種苗的毒害作用也逐漸變大，單獨處理的效果并不理想。而使用低劑量、重復次數可以減少對種苗的毒害作用，使用75%乙醇30 s+0.1%氯化汞 5 min+ 第2天重復的處理，可以使種苗的污染率控制在 11.6%，且對種芽傷害最低，種芽在4 d后就可變綠，展出真葉，綜合來看，使用75%乙醇30 s+0.1%氯化汞5 min+第2天重復是較為合適的消毒處理方法(表2)。

表1 不同激素處理對種子休眠的影響

表2 種芽消毒方式對種苗生長的影響

2.3 激素對組培苗快繁的影響

研究發現，將成苗的黃精組培苗轉接入不同的快繁培養基中后，黃精種芽組培苗對KT和ZT較敏感，其增殖系數要高于同濃度的BA，但會出現大量畸形葉，即使使用濃度較低仍有較多畸形葉片出現(表3)。因此，使用BA要比KT和ZT更適用于多花黃精種苗，結合增殖系數和組培苗生長情況，最適宜的快繁培養基為：S+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA，此時可以達到較好的增殖系數和組培苗正常的生長。

2.4 激素對組培苗生根的影響

將快繁后的種苗分株接入不同的生根培養基中后發現，NAA對多花黃精組培苗生根效果要好于IBA，而加入少量BA雖然對老葉片發黃有一定抑制作用，但會降低根長和生根數(表4)。因此，綜合生根效果和經濟性，適宜的生根配方為：MS+2 mg/L NAA+0.1%AC，在此配方下的生根數達到 5.5條，根長達到4.1 cm。

2.5 移栽基質對組培苗煉苗的影響

選取生根基本一致的組培苗進行煉苗處理，依次栽種入不同移栽基質，發現沙比蛭石更適合作為多花黃精煉苗基質，而同時加入沙、蛭石和單獨使用沙對種苗存活和生長并無明顯差距(表5)。因此，結合植株存活率和經濟性，在大規模煉苗生產中應選擇泥炭 ∶沙=2 ∶1的移栽基質配方，存活率達到83%以上，能夠達到移栽種植多花黃精組培苗的要求。

表4 黃精組培苗生根情況

表5 黃精組培苗煉苗情況

3 結論

本研究表明，多花黃精種子在未處理的自然條件下，發芽率僅為9.3%，不適合直接進行育苗。而以300 mg/L GA3+300 mg/L 2-ip的激素處理，其發芽率達到91.7%，達到了大規模育苗的要求，是打破多花黃精種子休眠的最佳方式；最佳外植體處理方法75%乙醇30 s+0.1%氯化汞5 min后并在第2天重復的處理；優選的增殖培養基為MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA，生根培養基為MS+2 mg/L NAA+0.1% AC；煉苗移栽基質以泥炭 ∶沙=2 ∶1最佳，成活率可達83%以上。本試驗結果將為多花黃精規模化種子育苗、組培育苗和中下游產業開發提供一定技術基礎。