甲狀腺乳頭狀癌中PD-L1蛋白表達(dá)與BRAF V600E基因突變的相關(guān)性

羅華榮，甘梅富，徐鋮，徐偉銘，梁勇

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）恩澤醫(yī)院 病理科，浙江 臺(tái)州 318050；3.臺(tái)州學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000）

近年來(lái)甲狀腺癌的發(fā)病率逐年上升，已躍居女性常見(jiàn)腫瘤的第5位[1]。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺最常見(jiàn)的惡性腫瘤，受環(huán)境、遺傳和激素等多種因素的影響，并與慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（chronic lymphocytic thyroiditis，CLT）明顯相關(guān)。程序性死亡配體-1（programmed death ligand 1，PD-L1）是重要的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)分子，能夠抑制T淋巴細(xì)胞的功能，是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生免疫逃逸的重要原因之一[2]。目前關(guān)于PD-L1蛋白在甲狀腺疾病中的研究較少，尚處于初始的探索階段。BRAF V600E基因突變是PTC最常見(jiàn)的分子事件，在PTC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[3]。本研究通過(guò)檢測(cè)PTC組織中PD-L1蛋白的表達(dá)，探討其與PTC臨床病理特征及BRAF V600E基因突變的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）恩醫(yī)院病理科2017年1月至12月間手術(shù)切除原發(fā)性PTC連續(xù)標(biāo)本74例。其中男21例，女53例，年齡17～72歲，平均（47±12）歲。根據(jù)AJCC第8版甲狀腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)[4]，以55歲作為診斷年齡切點(diǎn)，＜55歲57例，≥55歲17例；I期59例，II期10例，III～I(xiàn)V期5例。按2004年WHO頒布的PTC分類分為經(jīng)典型66例，濾泡亞型8例。腫瘤直徑≤2 cm 50例，＞2 cm且≤4 cm 20例，＞4 cm 4例。甲狀腺外浸潤(rùn)55例，未浸潤(rùn)19例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，未轉(zhuǎn)移34例。35例伴有CLT（CLT），39例不伴有CLT（Non-CLT）。選取甲狀腺癌組織邊緣＞2 cm或?qū)?cè)正常甲狀腺組織作癌旁對(duì)照組。所有標(biāo)本的患者術(shù)前均未接受治療。

1.2 主要試劑 兔抗人單克隆抗體PD-L1（SP142）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，EnVision檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自丹麥Dako公司，人類BRAF V600E基因突變檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 方法 所有手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE染色，光鏡下評(píng)估腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）情況。PD-L1檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)Envision兩步法，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，高溫高壓抗原修復(fù)，DAB顯色。BRAF V600E基因檢測(cè)采用Q-PCR法，操作步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，石蠟組織提取DNA，樣本DNA評(píng)估設(shè)有陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品（純化水）。分析儀器：ABI 7500（Applied Biosystems，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.4 結(jié)果判定 參照乳腺癌TILs評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[5]，以單核炎癥細(xì)胞占腫瘤間質(zhì)面積的平均百分比評(píng)估：TILs占腫瘤間質(zhì)≥10%為T(mén)ILs-rich，TILs占腫瘤間質(zhì)＜10%為T(mén)ILs-poor。PD-L1蛋白陽(yáng)性診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：＞5%的腫瘤細(xì)胞有明確的細(xì)胞膜或/和細(xì)胞質(zhì)著色。BRAF V600E基因突變的判定：樣本FAM信號(hào)Ct值＜28為陽(yáng)性，樣本FAM信號(hào)Ct值≥28或低于試劑盒的檢測(cè)下限為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。單因素比較采用χ2檢驗(yàn)，采用多因素logistic回歸模型評(píng)估影響PD-L1蛋白表達(dá)的臨床病理因素，采用Kappa一致性檢驗(yàn)評(píng)判PD-L1蛋白表達(dá)和BRAF V600E基因突變的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1蛋白的表達(dá) PD-L1蛋白在PTC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為48.6%（36/74），以腫瘤細(xì)胞的灶性表達(dá)為主，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)弱不等的棕黃色著色；對(duì)照組PD-L1蛋白的表達(dá)率為0（0/74）。PTC組與對(duì)照組的PD-L1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=47.571，P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 PD-L1蛋白在PTC組織中的表達(dá)

2.2 PD-L1蛋白表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系 PDL1蛋白在不同年齡、腫瘤大小、TILs豐富程度、CLT背景及臨床分期組別中的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PD-L1蛋白在不同性別、不同組織學(xué)類型、有無(wú)腺外浸潤(rùn)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組別中的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 BRAF V600E基因突變與PTC臨床病理特征的關(guān)系 74例PTC中BRAF V600E基因突變的陽(yáng)性率為79.7%（59/74）。對(duì)照組中BRAF V600E基因突變的陽(yáng)性率為0（0/74）。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。BRAF V600E基因突變與PTC的組織學(xué)分型有關(guān)（P＜0.01）；BRAF V600E基因突變?cè)诓煌詣e、年齡、腫瘤大小、CLT背景、TILs豐富程度、有無(wú)腺外浸潤(rùn)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期組別中的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表1 PD-L1蛋白表達(dá)與PTC臨床病理參數(shù)的關(guān)系（例）

2.4 PTC組織中PD-L1蛋白表達(dá)和BRAF V600E基因突變的相關(guān)性 在PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的PTC組織中BRAF V600E基因突變率為75.0%（27/36），在PD-L1蛋白陰性表達(dá)的PTC組織中BRAF V600E基因突變率為84.2%（32/38）。Kappa檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析表明，在PTC組織中，PD-L1蛋白表達(dá)和BRAF V600E基因突變之間缺少一致性（Kappa=-0.091，P=0.325）。

表2 BRAF V600E基因突變與PTC臨床病理參數(shù)的關(guān)系（例）

2.5 PD-L1蛋白表達(dá)的影響因素 取年齡、腫瘤大小、CLT背景、TILs豐富程度、臨床分期為自變量，以PD-L1蛋白表達(dá)為應(yīng)變量，采用進(jìn)入法做logistic回歸分析，結(jié)果顯示CLT背景是影響PD-L1蛋白表達(dá)的獨(dú)立因素（OR=18.675，95%CI：3.074～113.453，P＜0.01）。見(jiàn)表3。

3 討論

PD-L1又稱B7同源分子1（B7 homologue 1，B7-H1），是程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）的配體。PD-L1基因定位于人染色體的9p24，編碼含有290個(gè)氨基酸的I型跨膜蛋白。PD-L1蛋白和PD-1結(jié)合后，由PD-1傳遞抑制性信號(hào)，調(diào)控淋巴細(xì)胞功能，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制。此外，PD-1還可抑制炎性介質(zhì)的釋放，影響T細(xì)胞的分化，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成。PD-1/PD-L1通路參與了腫瘤的免疫應(yīng)答調(diào)控，在腫瘤免疫耐受的建立及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，以PD-L1為靶點(diǎn)的免疫檢查點(diǎn)阻斷療法已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的臨床治療[7]。研究表明，PD-L1可以在多種腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，如惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、腎癌等[8]。PDL1蛋白在PTC中也有表達(dá)，但目前相關(guān)的研究仍然較少。CHOWDHURY等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在66.5%的PTC病例中呈細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)，40.0%的病例呈細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，PD-L1蛋白在PTC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為48.6%，陽(yáng)性部位主要定位在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜或/和細(xì)胞質(zhì)上，PD-L1蛋白在PTC組與對(duì)照組中的表達(dá)差異顯著（P＜0.01），這與上述研究結(jié)果一致。

表3 PD-L1蛋白表達(dá)影響因素logistic回歸分析

至少有1/3的PTC組織中伴有CLT。HAYASHI等[10]發(fā)現(xiàn)，PD-L1基因的單核苷酸多態(tài)性在Graves病的發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。而Graves病的組織學(xué)主要表現(xiàn)就是CLT。本組結(jié)果顯示，PTC組織中CLT的比例達(dá)到47.3%（35/74），CLT組與Non-CLT組間的PD-L1蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且CLT背景是影響PD-L1蛋白表達(dá)的獨(dú)立因素。可以推測(cè)，CLT與PD-L1蛋白之間可能存在著相同的信號(hào)通路，CLT可能是影響抗PD-L1免疫治療的重要因素。這有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。隨著免疫檢查點(diǎn)阻斷療法在腫瘤患者中的應(yīng)用，研究者們發(fā)現(xiàn)抗PD-L1免疫治療只對(duì)某種腫瘤的一部分患者有效[11]。這種差異不僅和腫瘤中PD-L1蛋白表達(dá)有關(guān)，而且也和TILs的表達(dá)水平有關(guān)。這就要求我們必須根據(jù)PD-L1蛋白的和TILs的表達(dá)水平對(duì)不同病例采取個(gè)性化的免疫治療方法[12]。本研究顯示PD-L1蛋白在PTC組織中的表達(dá)隨著TILs的遞增而遞增，證實(shí)了PD-L1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與TILs的豐富程度有關(guān)。這與BAI等[6]的研究結(jié)果一致。此外，越來(lái)越多的研究認(rèn)為，PDL1蛋白表達(dá)可以作為判斷PTC預(yù)后的重要指標(biāo)，PDL1蛋白表達(dá)陽(yáng)性預(yù)示著更大的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和更短的無(wú)病生存期[9]。眾所周知，PTC的診斷年齡是PTC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13-14]。本研究結(jié)果顯示，高年齡組的PD-L1陽(yáng)性率高于低年齡組，PD-L1蛋白的表達(dá)與腫瘤大小及臨床分期有關(guān)，證實(shí)了PD-L1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)可能與PTC的侵襲性特征和不良預(yù)后有關(guān)。

BRAF V600E基因突變是PTC最常見(jiàn)的基因突變，對(duì)PTC的診斷、鑒別診斷及預(yù)后判斷均有重要價(jià)值[15]。BRAF V600E基因定位于人染色體7q34，編碼一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK激酶家族中最高效的磷酸化劑。目前能檢測(cè)到的BRAF V600E基因突變已經(jīng)超過(guò)30種，其中T1799A點(diǎn)突變是最常見(jiàn)的BRAF V600E激活突變[16]。研究結(jié)果表明，不同國(guó)家PTC組織中的BRAF V600E基因突變檢出率不同，歐美國(guó)家BRAF V600E突變率低于亞洲國(guó)家，說(shuō)明BRAF V600E基因突變可能存在種族差異。XING等[3]總結(jié)了1856例PTC檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)BRAF V600E的突變率為44%。本研究BRAF V600E基因突變的陽(yáng)性率為79.7%，與亞洲國(guó)家的檢出率相仿[6]。研究表明，BRAF V600E基因突變是PTC預(yù)后不良的指標(biāo)[15]。本組結(jié)果顯示，BRAF V600E基因突變率在不同性別、年齡、腫瘤大小、CLT背景、TILs豐富程度、腺外浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期中的組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與入組的中晚期患者過(guò)少有關(guān)，有待后續(xù)更大樣本的研究。本組BRAF V600E基因突變與PTC的經(jīng)典型組織學(xué)類型有關(guān)，與文獻(xiàn)[3]相符。ANGELL等[17]發(fā)現(xiàn)伴有BRAF V600E基因突變的PTC與PD-L1蛋白表達(dá)增高密切相關(guān)。而B(niǎo)AI等[6]通過(guò)免疫組織化學(xué)染色分析了126例PTC病例，結(jié)果顯示BRAF V600E的陽(yáng)性表達(dá)與PD-L1蛋白的表達(dá)沒(méi)有相關(guān)性，這與BASTMAN等[18]的研究結(jié)果一致。本研究通過(guò)Kappa檢驗(yàn)分析，并未發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白表達(dá)與BRAF V600E基因突變存在相關(guān)性。

綜上所述，PD-L1作為一種新的分子標(biāo)記物，有望成為PTC侵襲性特征的指標(biāo)，其表達(dá)與PTC的臨床病理特征有關(guān)?，F(xiàn)階段對(duì)于PD-L1蛋白表達(dá)與BRAF V600E基因突變的報(bào)道各異，可能與BRAF V600E基因突變?cè)诓煌朔N中的表達(dá)差異有關(guān)；同時(shí)，目前免疫組織化學(xué)檢測(cè)PD-L1尚無(wú)統(tǒng)一的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，不同克隆號(hào)抗體的陽(yáng)性截點(diǎn)不同，也導(dǎo)致了統(tǒng)計(jì)結(jié)果之間的差異。因此，對(duì)于PD-L1蛋白表達(dá)與BRAF V600E基因突變的相關(guān)性，仍需更深入的研究分析。