乙酸鈉通過抑制過度炎癥反應(yīng)保護(hù)乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃黏膜損傷

施伊露，張佳麗，喬莞寧，陳潔，蘇煒，張錚錚，董人杰，王方巖，黃穎鵬

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325027）

胃黏膜損傷是一種常見的消化系統(tǒng)病變，主要癥狀有上腹部疼痛、食欲減退、惡心嘔吐、反酸腹瀉等，且伴有上消化道出血、潰瘍穿孔、幽門梗塞等并發(fā)癥，甚至?xí)鸢┳僛1-2]。導(dǎo)致胃黏膜損傷的因素很多，如過量飲酒、應(yīng)激、長(zhǎng)期服用非甾體類抗炎藥物、幽門螺桿菌感染等。但現(xiàn)有的藥物對(duì)胃黏膜損傷的療效不甚理想，探索新的防治胃黏膜損傷的措施有著重要意義。

炎癥是造成胃黏膜損傷的重要因素。由于前列腺素在黏膜屏障中的重要作用和地位，常規(guī)用于抑制炎癥的非甾體類抗炎藥物反而會(huì)造成胃黏膜的損傷[3]。目前，臨床上缺乏針對(duì)胃黏膜炎癥的有效治療手段。乙酸屬于短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），具有維持水電解質(zhì)平衡、抗病原微生物和抗炎[4-5]、抗腫瘤[6]以及調(diào)控基因表達(dá)的作用[7]。在能量代謝方面，乙酸能夠降低肥胖的發(fā)生率[8]，降低血漿游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）濃度，還能通過改善胰島素靈敏度[9-12]來預(yù)防I I型糖尿病。有研究報(bào)道SCFAs對(duì)腸道疾病有防治作用[13]，因此，我們認(rèn)為乙酸很有可能對(duì)胃黏膜損傷具有潛在的療效。本研究以乙醇刺激復(fù)制小鼠胃黏膜損傷模型，利用乙酸鈉進(jìn)行干預(yù)，探究乙酸鈉對(duì)胃黏膜炎癥的影響，同時(shí)也為胃黏膜損傷防治的進(jìn)一步研究以及乙酸鈉藥用價(jià)值的開發(fā)提供借鑒和參考。

1 材料和方法

1.1 材料 GES-1和J774細(xì)胞系購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)。乙酸鈉（CAT：791741）、LPS（CAT：2880）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及建模：健康雄性ICR小鼠（SPF級(jí)），體質(zhì)量20～25 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXY（浙）2009-0129]。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和乙酸鈉組，每組9只，用苦味酸分別編號(hào)后將各組小鼠饑餓處理24 h（禁食不禁水），給乙酸鈉組和模型組小鼠分別灌胃乙酸鈉溶液（3.5 g/kg）和pH 9.5的NaHCO3溶液，劑量為0.1 mL/10 g，正常對(duì)照組不做處理。各組給藥30 min后，用乙醇灌胃進(jìn)行急性胃黏膜損傷造模。乙醇灌胃1 h后，用頸椎脫臼法處死小鼠。剪取胃組織，將標(biāo)本分為兩部分。一部分放入液氮中，另一部分則浸入4%多聚甲醛中固定，以備后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2 胃潰瘍面積的計(jì)算：對(duì)胃組織進(jìn)行胃黏膜面色澤，有無糜爛、潰瘍等典型變化的肉眼觀察，并立即拍照，獲得的圖像再用軟件Image-Pro Plus（IPP）6.0測(cè)量胃組織的總面積及出血潰瘍面，并計(jì)算二者的相對(duì)面積比例。

1.2.3 離體細(xì)胞培養(yǎng)：人正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1和小鼠巨噬細(xì)胞系J774于含10% FBS的1640培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中以5% CO2、37 ℃及飽和濕度條件下培養(yǎng)傳代。每2～3 d換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)＞80%并覆蓋培養(yǎng)瓶底，進(jìn)行傳代，1000 r/min離心5 min后，按1∶3分至新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待用。

1.2.4 乙醇誘導(dǎo)GES-1損傷模型及乙酸鈉干預(yù)及分組：利用8%的乙醇對(duì)GES-1進(jìn)行損傷刺激4 h[14]，并同時(shí)給予不同濃度的乙酸鈉干預(yù)，實(shí)驗(yàn)分組如下：正常組、乙醇組、乙醇+10 μmol/L乙酸鈉組、乙醇+100 μmol/L乙酸鈉組和乙醇+1 mmol/L乙酸鈉組。刺激結(jié)束后，通過CCK-8試劑盒對(duì)細(xì)胞的活力進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 LPS誘導(dǎo)炎癥模型及乙酸鈉干預(yù)及分組：以100 ng/mL LPS刺激J774細(xì)胞系誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)1 h，并同時(shí)利用不同濃度的乙酸鈉進(jìn)行干預(yù)，實(shí)驗(yàn)分組如下：正常組、LPS組、LPS+10 μmol/L乙酸鈉組、LPS+100 μmol/L乙酸鈉組和LPS+1 mmol/L乙酸鈉組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集細(xì)胞用于細(xì)胞因子檢測(cè)。

1.2.6 RT-qPCR測(cè)定炎癥因子：取適量標(biāo)本，加入1 mL Trizol試劑后充分勻漿，常規(guī)操作提取總RNA。使用核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA濃度及純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根生化科技有限公司，KT201）說明書合成樣品cDNA。以合成的cDNA為模板，按熒光定量PCR試劑盒（大連TaKaRa公司，RR820A）說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s后采集熒光信號(hào)，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，方差齊性則采用Bonferroni法，方差不齊者用Dunnet’sT3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 乙酸鈉對(duì)乙醇誘導(dǎo)胃黏膜損傷的保護(hù)作用 正常對(duì)照組：胃黏膜皺裂有序，黏膜色淡粉紅，表面光滑，無潰瘍、糜爛、充血、水腫；模型組：胃黏膜片塊壞死脫落，充血水腫，形成潰瘍；乙酸鈉組：胃黏膜層可見斑點(diǎn)狀損傷，損傷面積較小且表面比模型組光滑。通過對(duì)潰瘍面積的計(jì)算并進(jìn)行組間比較發(fā)現(xiàn)，模型組的潰瘍較為明顯，但乙酸鈉能夠顯著改善乙醇造成的胃黏膜損傷，見圖1。這些結(jié)果表明，乙酸鈉對(duì)乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷具有保護(hù)作用。

圖13組胃黏膜潰瘍面積比較

2.2 乙酸鈉抑制乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍炎癥反應(yīng) 與模型組相比，乙酸鈉處理能明顯降低乙醇誘導(dǎo)引起的小鼠胃組織IL-1β、TNFα和MCP-1升高（P＜0.01），見圖2。

圖2 乙酸鈉對(duì)胃黏膜炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

2.3 乙酸鈉對(duì)乙醇誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 經(jīng)8%的乙醇刺激4 h后，模型組的細(xì)胞增殖率與正常對(duì)照組相比明顯降低；但在不同濃度的乙酸鈉的干預(yù)下，細(xì)胞活力較模型組明顯升高（P＜0.01）。見圖3。

2.4 乙酸鈉抑制LPS誘導(dǎo)J774細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng) LPS刺激J774細(xì)胞1 h，IL-1β、TNFα和MCP-1表達(dá)水平較正常組顯著上調(diào)（P＜0.01）。但不同劑量的乙酸鈉處理后，各炎癥因子的表達(dá)量受到顯著的抑制（P＜0.01），而各劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

3 討論

本研究采用乙醇為刺激因素復(fù)制小鼠急性胃黏膜損傷模型來探究乙酸鈉對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用[15]。在正常情況下，胃攻擊因子與防御因子處于一種平衡狀態(tài)，胃黏膜可以抵抗胃酸和胃蛋白酶的攻擊。通過乙醇的強(qiáng)烈刺激，導(dǎo)致攻擊因子與防御因子失衡，一方面乙醇直接損傷胃黏膜，另一方面由于胃黏膜的損傷導(dǎo)致胃酸和胃蛋白酶對(duì)胃黏膜的攻擊，造成急性的胃黏膜損傷[16]。該模型能夠很好地模擬過量飲酒造成的急性胃黏膜損傷，也是篩選胃黏膜防治藥物的首選模型。

圖3 不同濃度乙酸鈉對(duì)乙醇所致GES-1細(xì)胞損傷的影響

在對(duì)胃的大體觀測(cè)中發(fā)現(xiàn)乙醇造成胃黏膜的嚴(yán)重?fù)p傷，呈現(xiàn)大面積的出血糜爛，而在使用乙酸鈉后胃黏膜得到很好的保護(hù)。由于乙酸鈉呈堿性，其保護(hù)作用可能是由于中和了胃酸導(dǎo)致的，我們?cè)谀Ｐ徒M給予了相關(guān)pH值的NaHCO3，但并未觀測(cè)到任何保護(hù)作用，所以，乙酸鈉的保護(hù)作用與其呈堿性特性無關(guān)。

在正常人胃黏膜細(xì)胞株上，我們發(fā)現(xiàn)各濃度的乙酸鈉均可以拮抗乙醇造成的GES-1損傷，而且以低濃度為著。乙酸作為二碳的短鏈脂肪酸，是腸道黏膜主要能源之一，對(duì)腸黏膜細(xì)胞的損傷也具有保護(hù)作用[17]。胃黏膜與腸黏膜具有較高的同源性。我們的數(shù)據(jù)證實(shí)了我們的假設(shè)即乙酸鈉對(duì)胃黏膜具有直接的保護(hù)作用。

圖4 乙酸鈉抑制LPS誘導(dǎo)的J774巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)

炎癥在胃黏膜損傷的發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，促炎癥因子IL-1β和TNFα參與乙醇介導(dǎo)的胃黏膜損傷[18]。研究發(fā)現(xiàn)在乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷中，MCP-1的表達(dá)水平顯著提高，該結(jié)果提示MCP-1作為重要的趨化因子，在胃黏膜的損傷機(jī)制中也具有重要的地位[19]。以往研究表明，通過具有抗炎作用的化合物干預(yù)能夠減輕乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷[20]。本研究中，我們通過RT-qPCR的方法檢測(cè)了IL-1β、TNFα和MCP-1的表達(dá)水平。結(jié)果表明，乙醇刺激能夠誘導(dǎo)胃黏膜中上述炎癥因子的表達(dá)水平顯著提高，而乙酸鈉能夠顯著減低上述因子的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)乙酸對(duì)炎癥具有顯著的抑制作用，能夠調(diào)控免疫細(xì)胞的功能，減輕炎癥性腸?。╥nflammation bowl diseases，IBD）[21]。我們通過LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞株的炎癥反應(yīng)為模型，發(fā)現(xiàn)不同劑量的乙酸鈉均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而且各劑量組之間無差異。該結(jié)果提示乙酸作為常見的短鏈脂肪酸具有較寬的劑量適應(yīng)性，能夠在10 μmol/L～1 mmol/L的范圍內(nèi)發(fā)揮穩(wěn)定的抗炎效應(yīng)。離體實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)更為充分地證實(shí)乙酸鈉抑制炎癥反應(yīng)的作用是其抗胃黏膜損傷的重要機(jī)制。乙酸作為一種重要的短鏈脂肪酸，是腸道微生物的重要代謝產(chǎn)物，能夠抑制腸道腫瘤，調(diào)節(jié)腸道的免疫機(jī)能，抑制腸道內(nèi)的炎癥反應(yīng)。我們的研究則證實(shí)乙酸鈉能夠抑制乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜炎癥反應(yīng)，保護(hù)胃黏膜。但是，具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。