慢性鼻-鼻竇炎病人細菌生物膜的表達及分布

(青島大學附屬醫院，山東 青島 266003 1 耳鼻咽喉頭頸外科； 2 器官移植中心； 3 手術室)

慢性鼻-鼻竇炎(CRS)是耳鼻喉科常見多發病，嚴重影響人們的生活質量。研究者們認為CRS并非單一因素導致的疾病，多種因素可能獨立或協同參與了其發生發展過程。但臨床上仍有部分病人無論采取系統的保守治療(全身和鼻噴激素、黏液促排劑、抗生素治療)，還是鼻內鏡手術治療，或是手術結合藥物的綜合治療，其臨床治療效果仍不滿意。國內外學者研究發現細菌生物膜(BBF)是導致臨床治療CRS效果差的重要影響因素[1-5]。BBF是通過細菌及其自身分泌的胞外多糖類聚合物相互粘連而成的群落，其可黏附于物體表面，生物膜中的細菌對抗生素的耐藥性是浮游狀態的500～1 000倍[6]，因此，確定鼻腔/鼻竇黏膜是否存在BBF可以為臨床治療CRS提供重要參考。2004年CRYER等[7]首次報道了BBF在CRS病人鼻腔/鼻竇黏膜的存在。

文獻報道的CRS病人鼻黏膜BBF檢出的陽性率為25%～100%[8-10]。目前國內學者多以掃描電鏡來觀察BBF，且病例樣本數較少。本實驗的目的是以激光掃描共聚焦顯微鏡觀察CRS病人鼻腔/鼻竇黏膜表面BBF的形成情況和形態特點，并比較鼻腔不同解剖部位BBF表達的差異，分析BBF與CRS的相關性。現將結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2016年1月—2017年9月在我院住院行鼻內鏡手術治療的病人共67例，其中實驗組分為CRS伴鼻息肉(CRSwNP)組共27例，CRS不伴鼻息肉(CRSsNP)組共25例，病人均符合EPOS-2007所提供的CRS伴/不伴鼻息肉的診斷標準。對照組15例病人中，外傷性視神經病病人4例，骨瘤病人3例，單純上頜竇囊腫病人8例；對照組病人均無鼻竇炎或鼻炎病史以及流涕、鼻涕倒流、鼻塞等相關鼻部癥狀，體格檢查鼻腔黏膜未見異常。所有病人均排除免疫系統疾病及糖尿病、不動纖毛綜合征、術前激素治療史、妊娠及腫瘤病人。所有病人均同意接受手術治療及將術中所取標本用于本次研究。

1.2 研究方法

3組病人鼻內鏡手術時由同一術者取得中鼻甲、鉤突及前篩、后篩黏膜。取下黏膜標本后，選取較薄的部分，切除約5～10 mm2大小，置于DMEM高糖培養基中冰袋冷藏，1 h內送至我院中心實驗室以生理鹽水反復洗滌黏膜標本3次約10 min。后將標本完全置于活/死菌熒光染色劑(BacLight LIVE/DEAD)中，室溫暗室放置15～20 min，具體時間視標本的厚薄和大小而定，如果所取標本較厚或較大，染色時間需要延長。再以生理鹽水反復洗滌3次約10 min，去除標本表面的染色劑。將洗凈的標本置于載玻片上，以防淬滅甘油封片。使用激光掃描共聚焦顯微鏡(分別設置488和523 nm波長，放大倍數為63倍)觀察BBF的形態特點，分析各組間及不同解剖部位生物膜表達的差異性，并對BBF的存在狀況與部分臨床指標的關系進行分析。

1.3 BBF陽性結果判斷

參考國內外文獻資料[11]，激光掃描共聚焦顯微鏡下BBF陽性的判斷標準：在5～10 μm大小的鼻腔/鼻竇黏膜細胞周圍觀察到適當大小及形態呈現綠色熒光的活菌(直徑為0.5～2 μm)聚集成微群落，并被云霧狀的綠色胞外多糖類物質緊密包繞。

1.4 各指標評分

鼻部癥狀評分：采用VAS評價方法，鼻部癥狀最嚴重為10分，無癥狀為0分。鼻內鏡評分：根據1997年Lund-Kennedy鼻內鏡評分標準進行評分；影像學評分：采用Lund-Mackay評分系統對研究對象的鼻竇CT結果進行評分。

2 結 果

2.1 BBF的形態

激光掃描共聚焦顯微鏡下可見，實驗組在5～10 μm大小的鼻竇黏膜細胞周圍，有棒狀或球形、直徑為0.5～2.0 μm、呈現綠色熒光的活菌聚集成微菌落，被云霧狀的同樣呈現綠色熒光的胞外多糖類物質緊密包繞，見圖1。

白色箭頭指向BBF。

2.2 實驗組與對照組BBF表達結果

CRSwNP組27例病人中有22例黏膜表面檢測到BBF，陽性率為81.48%；CRSsNP組25例病人中有14例檢測到BBF，陽性率為56.00%；對照組15例病人中未發現BBF。不同組生物膜表達陽性率比較，差異均有統計學意義(χ2=3.957～25.667，P<0.05)。

2.3 鼻腔不同解剖部位BBF表達結果

中鼻甲黏膜表面有16例檢測到BBF，陽性率為30.77%；鉤突黏膜表面有25例檢測到BBF，陽性率為48.08%；篩竇黏膜表面有32例檢測到BBF，陽性率為61.54%。中鼻甲BBF表達的陽性率與篩竇比較，差異有顯著性(χ2=9.905，P<0.05)。

2.4 實驗組中BBF陽性與陰性組臨床部分指標的比較

實驗組中BBF陽性的CRS病人(36例)鼻部癥狀評分和鼻竇內鏡評分與陰性病人(16例)比較，差異有顯著性(t=5.71、t′=6.62，P<0.05)。而有無吸煙史、有無哮喘病史、既往有無鼻竇手術史、病史長短及標本側CT評分，兩組之間比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 實驗組中BBF陽性與陰性組臨床部分指標比較

3 討 論

BBF是細菌在不利于其生長的環境中通過產生胞外多聚糖被膜，使其相互粘連而形成的微群落。其可以由單一的菌種組成，也可由多種細菌混合組成。自然界中大約有99%的細菌以生物膜的形式存在，僅1%的細菌以浮游方式生存[12]。臨床上許多頑固性、難治性感染都與BBF的形成有關。

近年來，相關研究已經證實CRS病人鼻黏膜存在BBF。SUN等[13]觀察了31例CRS病人的手術黏膜樣本，結果顯示BBF的表達率為64.51%。張孜等[14]用掃描電鏡觀察了12例CRS病人的手術黏膜樣本，結果BBF的表達率為83.3%。本研究利用激光掃描共聚焦顯微鏡，發現27例鼻息肉病人中22例可以檢出BBF，陽性率為81.48%，25例CRS病人中有14例可以檢出BBF，陽性率為56.00%，但是對照組15例均沒有檢測出BBF。本研究實驗組與對照組陽性率比較差異有顯著性。這與以往文獻報道的結果是一致的。提示BBF的存在與CRS的發病尤其是鼻息肉的發病密切相關，BBF可能是CRS的發病原因之一。但也有部分學者研究認為CRS的發病與BBF無相關性[15-17]。這也許是由于檢測方法不同導致的。目前檢測BBF的主要方法有透射電鏡、掃描電鏡、原位熒光雜交及激光掃描共聚焦顯微鏡等。激光掃描共聚焦顯微鏡可以對細菌及生物膜中各種成分進行不同顏色的熒光染色，且避免對BBF結構的破壞，對標本可以進行無損傷“光學切片”和成像，可做活體研究。HA等[18]認為激光掃描共聚焦顯微鏡是目前檢測鼻竇黏膜BBF的最佳方法。本實驗采用活/死菌熒光染色劑，將活體的鼻腔/鼻竇黏膜細胞或細菌染成綠色，將死亡的細胞或細菌染為紅色。為保證實驗的可靠性，盡可能不破壞BBF在機體內的原始狀態，經鼻內鏡留取鼻黏膜標本后，立即進行染色及激光掃描共聚焦顯微鏡鏡下觀察，標本留取到掃描完成的時間窗控制在60 min內。另外本研究還發現，BBF在篩竇黏膜表達的陽性率較在中鼻甲表達的陽性率明顯增高，提示BBF可能更容易定植于鼻腔深部無明顯氣流的部位。BBF在鼻腔不同解剖部位的表達之前未見報道。這也可以解釋為什么鼻息肉組BBF的陽性率更高，因為大部分的鼻息肉起源于篩竇。

CRS病人的病史、主觀癥狀、鼻腔局部檢查、影像學檢查是反應疾病嚴重程度、決定治療方式的重要指征。為了研究BBF與CRS的相關性，本研究采用病史長短、癥狀評分、Lund-Kennedy鼻內鏡評分及Lund-Mackay CT影像學評分等評價指標進行分析。本研究中，生物膜陽性的CRS病人的癥狀評分、鼻內鏡評分與生物膜陰性病人比較，差異有顯著性，提示BBF可能與CRS的病情嚴重程度相關。雖然本研究BBF陽性病人鼻竇影像學評分與陰性病人無明顯差異，但是也表現出升高的趨勢。

36例BBF陽性的CRS病人中，有鼻竇手術史的病人有6例(16.67%)，而16例BBF陰性的CRS病人中，有鼻竇手術史的病人僅1例(6.25%)，提示BBF的存在增加了CRS的難治性。雖然兩組經校正的卡方檢驗，差異無顯著性，但是手術有可能造成鼻竇黏膜的損傷，繼而容易導致細菌的定植。因此術者在術中應強化無菌觀念，嚴格無菌技術操作，有鼻腔疾病的病人應保持鼻部清潔，減少CRS的發病風險。在后續研究中，可以通過加大樣本量，對手術與BBF關系做進一步的觀察。FERGUSON等[19]認為手術是清除CRS病人BBF的唯一手段，但由于目前技術限制，鼻內鏡手術過程中發現BBF黏附的確切部位和范圍尚未成為可能，BBF的實驗室檢測手段仍不成熟，無法為臨床手術治療提供有力的支持，手術無法達到徹底清除生物膜的目的。術中殘留的BBF成為鼻竇炎復發的隱患，多數狀態下細菌蟄伏不表現炎癥癥狀，一旦達到其良好的生長條件，細菌將會以浮游狀態再次活躍起來，炎性癥狀隨之出現。BBF的存在，可能是CRS難治的原因之一，也可能是鼻內鏡手術后部分病人療效欠佳的原因之一。

隨著近年來對BBF的特性、結構及耐藥機制的研究，人們對其有了較深的了解，但是BBF在CRS發病中的具體作用機制尚未完全闡明，未來的研究目標是找到BBF可靠規范的檢測標準及方法，同時還應找到BBF形成發生的根源，探討阻止BBF形成的方法，例如通過藥物控制的手段阻止其形成，并進一步探索如何有效清除已存在的生物膜，使CRS得到有效控制。