miRNA對Fontan術后血小板活化程度及血栓形成影響的精確預測價值

(上海交通大學醫學院，上海 200092 1 附屬新華醫院兒心血管科； 2 附屬上海兒童醫學中心心臟中心)

臨床一些復雜性先天性心臟病，如三尖瓣閉鎖、單心室、肺動脈閉鎖伴室間隔完整等病兒多數需行Fontan手術以降低死亡率。Fontan手術是將上、下腔靜脈直接連接到肺動脈，從而使肺循環和體循環分開，該手術雖然一定程度能夠減輕病兒低氧狀況，但術后一些常見并發癥，如心律失常、血栓栓塞、腔靜脈壓力升高及心力衰竭等可能會致病兒死亡[1]。由于腔靜脈血直接回流肺動脈，使肺動脈缺少“脈沖性”血流灌注，可造成術后肺動脈狹窄、扭曲，肺血栓和肺動脈高壓形成，且隨生存時間延長而日益明顯。多項臨床研究表明，Fontan術后血栓栓塞是造成病人死亡的重要原因。Fontan術后血栓形成常見原因有血管內皮受損、血管狹窄、凝血功能異常等。臨床研究發現一些微小核糖核酸(miRNA)與血管內皮損傷和血小板活化、血栓形成等有關。血管內皮損傷以后miR-126以及miR-21常升高，而miR-96、miR-340以及miR-223升高則提示血小板活化[2]。本研究主要探討外周血白細胞、血小板以及血清中miRNA變化能否準確預測單心室病兒行Fontan術后對血小板活化以及血栓形成的影響，旨在為臨床隨訪及抗血栓治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

單心室行Fontan術后病兒6例(TG組)，男4例，女2例；年齡2～11歲，平均5.6歲；術后時間為1～5年。體檢正常的兒童6例(CG組)，男3例，女3例；年齡2～12歲，平均6.2歲。試驗前收集血液標本均告知家長并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑

CO2細胞培養箱(Thermo Scientific，Waltham，美國)；倒置顯微鏡(Olympus，Tokyo，日本)；電泳儀和電轉儀(BIO-RAD，Irvine，美國)；Real-time檢測儀(天龍，TL988)。Ficoll(GE，17-5442-02,美國)；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit等試劑盒(Takara，日本)；Ikkb Antibody等抗體(Affinity，AF6009，美國)；RIPA組織細胞快速裂解液(Solarbio，R0010)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermos，PICPI23223，美國)等。

1.3 實驗方法

1.3.1血清、血小板和白細胞中miRNA提取 采集病兒靜脈血15 mL,分別用于血清、血小板和白細胞中miRNA提取。①血清miRNA提取：將其中的5 mL靜脈血置于干管中，30 min內高速離心(3 000 r/min離心10 min，后8 000 r/min離心15 min)分離血清。加入QIAzol試劑使血清變性，然后用Qiagen miRNeasy Mini Kit進行RNA采集和純化。②血小板miRNA提取：將其中5 mL靜脈血置于抗凝管中，4 ℃靜止過夜收集上清液。采用DEPC水稀釋血清，然后12 000 r/min低溫離心10 min，收集血小板，用于提取miRNA。③白細胞miRNA提取：將其中5 mL靜脈血以淋巴分離液Ficoll分離出單個核細胞，用于提取miRNA。

1.3.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測不同標本中miRNA的表達 常規配置反應液，反轉錄反應條件如下:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。各引物如下：內參照U6正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈：5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′；miR-223正義鏈：5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反義鏈：5′-CCAGTCTCAG-GGTCCGAGGTATTC-3′；miR-150正義鏈：5′-TG-CGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反義鏈：5′-TGCG-GCTCTCCCAACCCTTGTA-3′；miR-126正義鏈：5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反義鏈：5′-TGCGGCCATTATTACTTTT-3′；miR-21正義鏈：5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反義鏈5′-TGCGGCTAGCTTATCAGACT-3′；miR-197正義鏈：5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反義鏈：5′-TGCGGCTTCACCACCTTCTCCA-3′。點好樣的PCR板放置于Real time PCR儀上進行PCR反應，95 ℃預變性30 s；然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共進行40個循環；循環結束后進行熔解曲線分析，通過檢測Ct值，定量分析樣本中miRNA的表達量。

1.3.3流式細胞儀檢測外周血血小板活化水平以抗凝管采集CG和TG組兒童外周靜脈血5 mL，室溫下1 000 r/min離心10 min，上層淡黃色液體即為富血小板血漿(PRP)。緩慢吸出PRP置于新的離心管中，繼續室溫下4 000 r/min離心10 min后棄去上清液，所剩的部分為血小板沉淀。用含有1 g/L BSA和0.01 mol/L EDTA的PBS(0.01 mol/L)1 mL沖洗血小板沉淀，室溫下離心4 000 r/min離心10 min后再次棄去上清，重復3次，以此提純血小板沉淀。提純的血小板加入PBS 190 μL，混勻后均分成兩份，分別加入5 μL CD41a-PE抗體和5 μL CD62p-PE抗體，渦旋混勻；4 ℃孵育30 min；加入10倍體積的PBS，洗滌2次，流式細胞儀分選收集CD41a、CD62p陽性的細胞。

1.3.4Western Blot檢測白細胞內抑制miR-223表達對Iκb和p-p65及NF-κB蛋白的影響 采集TG組和CG組抗凝外周血，將插入miR-223轉錄抑制因子的慢病毒轉染各組的外周血白細胞，分為CG+病毒無轉錄抑制因子組(CC組)，TG+病毒無轉錄抑制因子組(TC組)，CG+病毒含轉錄抑制因子組(CI組)和TG+病毒含轉錄抑制因子組(TI組)。觀察當miR-223表達抑制后，對白細胞NF-κB信號路徑中IKKb、Iκb以及NF-κB表達的影響。步驟如下。①蛋白收集：經慢病毒轉染72 h后收集各組細胞，2 000 r/min離心10 min，棄上清液；PBS洗滌；加入RIPA裂解液裂解，離心后取上清液；②Western Blot檢測：將含有蛋白質樣品加入緩沖液，進行垂直平板凝膠電泳，在電泳結束前，鋪PVCF膜，放入電轉儀中，加入轉膜緩沖液，轉膜1 h；取膜以后以10 g/L的BSA室溫封閉2 h；然后分別加入TBST稀釋的一抗IKKb(1∶2 000)、Iκb(1∶2 000)、NF-κB(1∶3 000)、p-p65(1∶2 000)以及β-actin(1∶5 000)4 ℃孵育過夜。HRP標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h；加入化學發光試劑，至出現顯影條帶，取出包好PVDF膜，于暗室中用X膠片感光、顯影、定影，然后用圖像顯影儀進行分析，測平均灰度值。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 兩組miRNA表達比較

兩組miR-126、miR-223表達水平比較，差異有顯著性(t=3.22、3.45，P<0.05)。見表1。

表1 兩組病人血清中miRNA表達水平比較(n=6,±s)

表1 兩組病人血清中miRNA表達水平比較(n=6,±s)

分組miR21miR126miR150miR197miR223CG組1.183±0.6181.055±0.3301.107±0.5301.097±0.4371.028±0.245TG組2.028±1.0640.507±0.2560.718±0.4060.727±0.2921.718±0.424

2.2 兩組血小板活化情況比較

實驗結果顯示，CG組CD62p、CD41a表達率分別為(4.6±1.2)%、(2.6±0.3)%，而TG組血小板中CD62p、CD41a的表達率分別為(12.3±1.8)%、(18.4±2.5)%，兩組比較，差異有顯著性(t=17.57、87.54，P<0.01)。

2.3 qRT-PCR檢測外周血血小板和白細胞中miR-223表達水平

以CG組外周血血小板或白細胞中miR-223相對表達水平為1，TG組外周血血小板中miR-223表達水平為6.2±0.52，而外周血白細胞中miR-223表達水平為5.4±0.56，兩組比較，差異具有統計學意義(t=5.62、4.32，P<0.05)。

2.4 含miR-223抑制因子的慢病毒轉染正常人白細胞對miR-223表達的影響

以CC組白細胞中miR-223相對表達水平為1，CI組白細胞中miR-223表達水平為0.36±0.04，兩組比較，差異有顯著性(t=45.30，P<0.01)。

2.5 白細胞內miR-223表達抑制后對Iκb和p-p65及NF-κB表達的影響

與CC組比較，TC組白細胞中Iκb蛋白表達下調，p-p65蛋白表達上調，CI組白細胞中Iκb蛋白表達上調，p-p65蛋白表達下調；與CI組比較，TI組白細胞中Iκb蛋白表達下調，p-p65蛋白表達上調。Ikkb和NF-κB蛋白表達在不同處理組間無明顯變化。見圖1。

①CC組；②TC組；③CI組；④TI組。

3 討 論

Fontan術后血栓栓塞是病兒重要的死亡原因之一，主要和血管內皮受損、血管平滑肌增生和血小板活化等有關[3-5]。由于部分血栓栓塞無明顯臨床癥狀，故其真實發生率難以估計[6-7]。MONAGLE等[8]分析了多中心資料估測發生率為3%～16%，KHAIRY等[9]分析波士頓兒童醫院261例病例發現，Fontan術后因血栓導致的死亡10年時為1%～3%，25年時則高達9%～12%。并發現術后未應用抗凝或抗血小板治療是血栓栓塞性死亡的獨立危險因素。

最近研究顯示，miRNA可作為血管損傷的標志物，miRNA是高度保守的短鏈核糖核酸，廣泛參與調控基因表達[10-11]，其中miR-126、miR-21、miR-663與血管內皮損傷有關[12-13]；miR-153、miR-145/143、miR-223等可反映血管內皮增生的情況[14-15]，在血管狹窄的過程中胰島素樣生長因子1受體(ILGF1R)使血管平滑肌細胞增生，此時miR-223以及miR-153表達下調[16]。LAFFONT等[17]發現miR-223在血小板活化過程中高表達，可以作為凝血因子激活的指標。

本研究結果顯示，TG組病兒血清中miR-223表達水平較CG組明顯升高，當其升高時，血小板活化率也同時增強。血小板活化后，可釋放一些凝血因子如ADP、血栓素等，可促進血栓的形成[18]。此外，血小板中還含有豐富的miRNA[19]，進一步研究發現TG組病兒血小板和白細胞中miR-223表達增多，此時白細胞中NF-κB信號途徑中的Iκb蛋白表達下調，p-p65蛋白表達上調，通過慢病毒轉染抑制白細胞中miR-223的表達，CI組表現為Iκb蛋白表達上調，p-p65蛋白表達下調，但TI組與之相比，表現為Iκb蛋白表達下調，p-p65蛋白表達上調，說明白細胞中miR-223抑制后Iκb蛋白表達上調，p-p65蛋白表達下調。因此推測單心室行Fontan術后病兒白細胞中miR-223高于正常人，可造成Iκb蛋白表達水平降低而p-p65蛋白表達水平升高，繼而激活NF-κB信號通路，導致進一步病理生理改變。

NF-κB蛋白家族是一種多效性的轉錄因子，可以與多種基因啟動子部位的κb位點發生特異性結合從而促進其轉錄表達。NF-κB為p50/p65異源二聚體，Iκbα和Iκbβ主要與含有p65和Rel的二聚體具有高親和力，是體內NF-κB(p50-p65)的主要調控抑制蛋白。當細胞受到各種內外刺激后，Iκb激酶被激活，從而導致Iκb蛋白磷酸化、泛素化，然后Iκb蛋白被降解，使NF-κB二聚體得到釋放。釋放后的NF-κB二聚體通過各種翻譯后的修飾作用而被進一步激活，并轉移到細胞核中。在細胞核里與目的基因結合，促進目的基因的轉錄[20-21]。Fontan術后病兒外周血白細胞中Iκb降低，使白細胞內NF-κB活化，其活化后通過ICAM-1、VCAM-1與白細胞表面的配體相應地結合，介導白細胞貼壁黏附、聚集、浸潤，導致局部炎癥發生，從而使微血管內皮細胞損傷[22-23]。此外，NF-κB活化可促進血管性血友病因子(vWF)的表達。vWF是Ⅷ因子的相關因子，與Ⅷ因子結合，能有效防止Ⅷ因子在血漿中迅速降解。vWF與Ⅷ因子結合，組成FⅧ/vWF，一端與血小板糖蛋白Ib結合，另一端與內皮細胞下的膠原纖維連接，介導血小板黏附血管內皮，促進微血栓形成[24-25]。本實驗結果顯示，Fontan術后血流動力學改變可能激活Iκb激酶，從而使Iκb蛋白被降解，繼發引起NF-κB活化，造成血管內皮損傷和微血栓形成，這可能是Fontan術后血栓形成較重要的原因。

但NF-κB活化后，如何調節細胞核基因的轉錄并對血栓形成造成影響，其具體機制本研究未涉及，未來尚需進一步深入研究探討。