UPLC-MS/MS法同時檢測豬肉中磺胺類藥物殘留的不確定度

劉莉，虞冰，吾建祥，馬婧妤，楊德毅，刁銀軍

(1.金華市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量綜合監(jiān)督檢測中心，浙江 金華 321017； 2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321007)

磺胺類藥物(Sulfonamides，SAs)是一類抗菌作用高效且價格低廉的化學(xué)合成抗生素，廣泛應(yīng)用在生豬養(yǎng)殖過程中。SAs可在動物源性食品中殘留和蓄積，進(jìn)入人體后，可破壞造血系統(tǒng)，引起溶血性貧血[1-2]，而且SAs可導(dǎo)致病原體產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生過敏反應(yīng)[3-6]，危害人體健康。歐盟及我國規(guī)定，磺胺類藥物在肉類食品中最高殘留限量為：單一磺胺類藥物不超過25 μg·kg-1，磺胺類藥物總量不超過100 μg·kg-1[7-8]。

隨著人們對肉類食品質(zhì)量安全意識的提高，檢測機(jī)構(gòu)對獸藥殘留檢測的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也更加規(guī)范，通過嚴(yán)格控制質(zhì)量控制程序、提升實(shí)驗(yàn)室測試質(zhì)控能力、增加實(shí)驗(yàn)室間的檢測結(jié)果比對、溯源測量結(jié)果等措施增加測量結(jié)果的可靠性[9]。本文主要依據(jù)《畜禽肉中十六種磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(GB/T 20759—2006)對豬肉中3種磺胺類藥物殘留(磺胺甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺多辛)進(jìn)行檢測，研究檢測方法的不確定度的來源、評定、合成以及結(jié)果表示，通過建立測定豬肉中3種磺胺類藥物殘留方法的測量不確定度的模型，評定測量不確定度，使不確定度作為提高分析檢測結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性的理論依據(jù)[10-12]。

1 材料與方法

1.1 材料

豬肉購自金華農(nóng)貿(mào)市場。

LC-30A-LCMS-8050液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀、ESI-8050離子源、Sil-30AC自動進(jìn)樣器(日本島津公司)；均質(zhì)機(jī)(德國IKA公司)；N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司)；YQ116-01電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。乙腈、正己烷、無水硫酸鈉均為分析純；磺胺甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺多辛標(biāo)準(zhǔn)品(天津思億浩遠(yuǎn)科技有限公司)。

1.2 液相條件

色譜柱，島津Shim-pack GISS C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)。流動相A，0.2%甲酸水溶液，B，乙腈/甲醇(6∶4)溶液，初始濃度為10%。0～4.5 min，B線性變化至40%；4.5～4.6 min，40% B線性變化至95%；4.6～5.5 min，95% B保持不變；5.5～5.6 min，95% B線性變化至10%；5.6～9 min，10% B保持不變。流動相流速為0.4 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源，離子源溫度300 ℃，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多反應(yīng)檢測，電噴霧電壓5 000 V，加熱氣為空氣(10 L·min-1)，加熱溫度400 ℃，霧化氣為氮?dú)?3 L·min-1)，干燥氣為氮?dú)?10 L·min-1)，延遲時間3 ms，碰撞氣為氬氣(表1)。

表1 3種磺胺類藥物的檢測離子、對應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)及保留時間

注：*為定量離子。

1.4 樣品處理

稱取5 g豬肉(精確至0.01 g)樣品，放在50 mL離心管中，向離心管中加入20 mL乙腈和20 g無水硫酸鈉后，均質(zhì)1.5～2 min，3 000 r·min-1離心3 min，離心后的上清液倒入100 mL雞心瓶中，濾渣加入20 mL乙腈重復(fù)上述操作1次，合并的上清液一并加到雞心瓶中。向雞心瓶中加入10 mL異丙醇，50 ℃水浴旋蒸干，準(zhǔn)確加入1 mL流動相和1 mL正己烷溶解旋干物，溶解液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，1 min渦旋，3 000 r·min-1離心3 min，棄除上層，再加入1 mL正己烷，重復(fù)上述步驟1次。取下層清液，0.22 μm濾膜過濾后備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量數(shù)學(xué)模型

2.2 不確定度的來源

豬肉中3種磺胺類藥物殘留測定不確定度來源主要包括2大類：磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品稱量、稀釋等過程中引入的不確定度和豬肉中磺胺類藥物在稱量、樣品進(jìn)樣、樣品重復(fù)測定以及回收率等過程中引入的不確定度，計(jì)算合成不確定度(表2)。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度

表2 磺胺藥物在豬肉中殘留量測定的不確定度

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容引入的不確定度

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的不確定度

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

2.2.6 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

3種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各取1 μL分別測定，根據(jù)UPLC-MS/MS方法測定得到相應(yīng)的色譜峰面積Ai，用Excel擬合而成的線性回歸方程為A=ac+b。式中，a為斜率，b為截距。磺胺甲嘧啶的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合回歸方程為：Y=118 276X+6 743.4，R2=0.999 2；磺胺間甲氧嘧啶的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合回歸方程為：Y=59 784.482 8X+5 907.422 4，R2=0.999 0；磺胺多辛的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合回歸方程為：Y=97 845X+5 902.2，R2=0.999 9。3種磺胺類藥物擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度為Urel(mc)。

2.2.7 豬肉樣品稱量引入的不確定度

2.2.8 進(jìn)樣體積引入的不確定度

2.2.9 樣品重復(fù)檢測引入的不確定度

2.2.10 回收率引入的不確定度

2.3 擴(kuò)展不確定度

根據(jù)《化學(xué)分析測量不確定度評定》(JJF 1135—2005)，對于大多數(shù)測量采用包含因子(k=2)進(jìn)行衡量，則豬肉中磺胺類藥物殘留量的擴(kuò)展不確定度U=Urel×2×X，由此得到UPLC-MS/MS方法同時檢測豬肉中3種磺胺類藥物殘留量的結(jié)果(表3)。

表3 豬肉中磺胺類藥物殘留量的擴(kuò)展不確定度

2.4 影響不確定度因素的分析

采用UPLC-MS/MS方法同時檢測豬肉中3種磺胺類藥物殘留，檢測過程中引入的不確定度實(shí)驗(yàn)過程主要是加標(biāo)回收率、樣品重復(fù)測量、樣品稱量、擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線、配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量、標(biāo)準(zhǔn)品純度(圖1)。

圖1 不確定度評定結(jié)果分析

影響檢測的各個因素的不確定度范圍在0.000 408～0.026 720，磺胺多辛、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺甲嘧啶的合成不確定度在測定結(jié)果的比重分別是6.4%、5.9%和5.4%。從圖1可以看出，檢測磺胺多辛?xí)r，樣品重復(fù)檢測對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大；檢測磺胺間甲氧嘧啶時，擬合曲線產(chǎn)生的不確定度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大；檢測磺胺甲嘧啶時，擬合曲線產(chǎn)生的不確定度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大。樣品稱量對3種藥物殘留實(shí)驗(yàn)影響最小。

3 小結(jié)

在對豬肉中3種磺胺類藥物的分析檢測操作過程中，可以通過提高實(shí)驗(yàn)操作人員的專業(yè)素質(zhì)，增加平行樣品測定次數(shù)，并定期對氣相色譜儀進(jìn)行檢定，來減小分析測定結(jié)果的不確定度，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。