超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定楊梅中嘧菌酯殘留

王全勝，付巖，張亮，朱勇，趙健，吳銀良

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

嘧菌酯(Azoxystrobin)是新型高效、廣譜、內(nèi)吸性殺菌劑，對(duì)幾乎所有真菌綱(子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、卵菌綱和半知菌類)病害，如白粉病、銹病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的活性，其能夠與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)線粒體上細(xì)胞色素相結(jié)合，阻斷細(xì)胞色譜b和細(xì)胞色素c1之間的電子傳遞，抑制能量合成，進(jìn)而使細(xì)菌死亡[1]。目前，嘧菌酯在我國已登記用于水稻、黃瓜、馬鈴薯、葡萄、番茄等作物[2]，使用較廣。

楊梅屬于楊梅科楊梅屬，于我國浙江、江西、云南、福建等地均有種植。楊梅果樹病蟲害較多，白腐病等細(xì)菌病害時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重影響其品質(zhì)和產(chǎn)量[3]。而嘧菌酯因其廣譜高效等優(yōu)點(diǎn)可被用于楊梅上防治褐斑病等病害。因此，有必要對(duì)其使用后可能產(chǎn)生的殘留風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，而快速高效的殘留分析方法則不可或缺。本文擬基于QuEChERS方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (UPLC-MS/MS)，建立一種用于檢測楊梅中嘧菌酯殘留量的分析方法，以期為有效監(jiān)控楊梅中嘧菌酯殘留風(fēng)險(xiǎn)提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試楊梅品種為東魁楊梅。

試驗(yàn)儀器由Waters Xevo TQ MS超高相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀配Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；KS4000ic恒溫振蕩器(德國IKA公司)；3K15高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；GENIUS3旋渦混合器(德國IKA公司)；萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo 公司)；Milli-Q超純水儀(美國millipore公司)。試劑有乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；PSA(40～60 μm，上海安譜公司)；無水硫酸鎂及氯化鈉(分析純，中國國藥集團(tuán))；嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg·mL-1，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所)。

1.2 樣品前處理

1.2.1 提取

稱取樣品5 g(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中，加入20.0 mL乙腈，以350 r·min-1振蕩提取30 min后，加入5 g氯化鈉劇烈震蕩1 min，再以9 500 r·min-1離心1 min，待凈化。

1.2.2 凈化

取2 mL上清液于10 mL離心管中，加入100 mg PSA和300 mg無水硫酸鎂，漩渦1 min，9 500 r·min-1離心1 min。吸取凈化上清液1.00 mL至另一試管中并加入1.00 mL 0.1%甲酸溶液混合均勻，過0.22 μm濾膜后供UPLC-MS/MS測定。

1.3 儀器條件

流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)，采用梯度淋洗(表1)，色譜柱柱溫為35 ℃，進(jìn)樣體積10.0 μL。

離子源為電噴霧離子源，正離子掃描，采用多重反應(yīng)監(jiān)測模式(表2)，毛細(xì)管電壓為2.50 kV，霧化氣流速1 000 L·h-1，錐孔氣流速50 L·h-1，離子源溫度為150 ℃，霧化溫度為500 ℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

表2 多重反應(yīng)監(jiān)測

注：*為定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

首先對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。研究表明，嘧菌酯能在ESI+離子模式下產(chǎn)生豐富的離子碎片，并有較高的響應(yīng)值。通過利用儀器自帶的Intellistart軟件，確定嘧菌酯的定性定量離子對(duì)及其對(duì)應(yīng)的最優(yōu)碰撞電壓、錐孔電壓等條件。此外，為進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)譜條件，將嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)液在全掃描模式下分別優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔氣流速、脫溶劑氣流速等參數(shù)，最終確定嘧菌酯的質(zhì)譜條件。同時(shí)，為有效分離目標(biāo)物和雜質(zhì)，提高嘧菌酯的靈敏度，還對(duì)液相條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相分別為乙腈-水、乙腈-乙酸銨溶液、乙腈-甲酸溶液時(shí)，乙腈-甲酸溶液體系下的嘧菌酯響應(yīng)最高，這可能是由于甲酸提高了嘧菌酯的質(zhì)子化效率[4]，進(jìn)而提高了其靈敏度。與甲醇相比，選擇乙腈為流動(dòng)相時(shí)，相同梯度洗脫條件下出峰時(shí)間更快，能夠縮短樣品分析時(shí)間。因此，最終確定流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液-乙腈梯度洗脫，此條件下嘧菌酯響應(yīng)高，峰型好，保留時(shí)間適中。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)母液。將100 mg·L-1的嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)母液用定容溶劑(楊梅空白基質(zhì)提取液∶0.1%甲酸溶液1∶1)稀釋配制成10.0 mg·L-1作為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)母液，再用定容溶劑將其梯度稀釋成0.50、0.10、0.050、0.010、0.005、0.001 mg·L-1不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)工作液，按1.3節(jié)儀器條件進(jìn)行測定。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。結(jié)果表明，嘧菌酯在0.001～0.50 mg·L-1濃度線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5 523 549x-15 069，相關(guān)系數(shù)r為0.999 8。

圖1 楊梅基質(zhì)中嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

以3倍信噪比計(jì)算得出儀器的檢出限為5.5×10-14g，靈敏度較高。為確定方法的準(zhǔn)確度和精密度，取楊梅空白樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，添加水平分別為0.005、0.1、1.0 mg·kg-1，每處理重復(fù)5次，按1.2節(jié)前處理步驟進(jìn)行處理，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，嘧菌酯在楊梅中添加回收率為82%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～10.2%。說明該方法準(zhǔn)確度和精密度均較好，符合農(nóng)藥殘留分析的要求[5]。

表3 嘧菌酯在楊梅中的添加回收率

3 小結(jié)與討論

目前，關(guān)于嘧菌酯殘留分析方法的研究報(bào)道相對(duì)較少，其分析方法主要集中在氣相色譜檢測[6-10]，且前處理較為復(fù)雜。如李瑞娟等[11]使用QuEChERS法進(jìn)行前處理，采用氣相色譜-電子捕獲檢測器對(duì)小麥中嘧菌酯殘留量進(jìn)行檢測，其最小檢出量為5×10-12g，最低檢測濃度為0.01 mg·kg-1；曹俊麗等[12]利用氣相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)儀對(duì)稻田中的嘧菌酯進(jìn)行了檢測，方法檢出限為0.01 mg·kg-1左右，定量限為0.05 mg·kg-1；范麗麗等[13]建立了鐵皮石斛、浙貝母和人參中嘧菌酯的殘留分析方法，采用乙腈提取、二氯甲烷液液萃取、柱層析凈化、氣相色譜-電子捕獲檢測器檢測，方法的檢出限為0.002～0.004 mg·kg-1，定量限為0.01 mg·kg-1。上述整個(gè)分析過程耗時(shí)相對(duì)較長，不利于大批量樣品的分析測定和殘留風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控。本文所建立的方法基于QuEChERS法，并進(jìn)行了簡化，同時(shí)結(jié)合UPLC-MSMS檢測，大大縮短了樣品分析時(shí)間，且靈敏度、準(zhǔn)確度亦均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。總之，本研究通過對(duì)儀器條件和前處理方法的優(yōu)化，建立了楊梅中嘧菌酯殘留的殘留分析方法，可為有效監(jiān)控楊梅中嘧菌酯的殘留風(fēng)險(xiǎn)提供技術(shù)支撐。