益艾康治療對HIV-1感染者CCR5、CXCR4表達及T細胞活化水平的影響*

劉 真，李 強，鄧博文，李承乘，李 杰，桑 鋒，王丹妮，徐立然

(河南中醫藥大學第一附屬醫院艾滋病臨床研究中心，河南省病毒性疾病中醫藥防治重點實驗室，鄭州 450000)

HIV感染人體需要病毒與靶細胞表面CD4受體及輔助受體相互作用，HIV-1病毒株進入細胞的輔助受體主要為CCR5和CXCR4兩種[1]，目前基于HIV/AIDS感染后CD4+、CD8+T細胞表面CCR5和CXCR4的表達情況研究報道較多，但學者們并未取得統一性結論[2-3]。艾滋病病毒感染機體后會引起一系列的免疫反應，研究已表明人類白細胞抗原(HLA)分子介導的細胞毒性T淋巴細胞反應(CTL)對控制病毒的復制具有重要作用，白細胞分化抗原(CD38)和人類白細胞Ⅱ類抗原(HLA-DR)是反映細胞激活狀態的跨膜分子[4]。益艾康膠囊是治療艾滋病的臨床經驗方，已在國家中醫藥管理局艾滋病救治項目(河南)中推廣使用。臨床研究表明，該制劑在臨床推廣中顯著提高艾滋病患者的免疫力[5-6]。我們在前期的研究論文中報道了我國HIV-1感染者外周血CD8+T淋巴細胞表面激活分子CD38和HLA-DR表達水平升高[7]，而HIV感染后輔助受體表達與T細胞活化水平關系等方面的報道少見，尤其罕見中藥治療對細胞活化水平和輔助受體表達的研究。本研究分析了HIV感染者外周血CD8+T淋巴細胞表面CD38和HLA-DR表達水平與輔助受體表達關系，探討益艾康治療對艾滋病病毒感染引起免疫損傷的修復作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

65例HIV-1陽性標本來源于河南中醫藥大學第一附屬醫院艾滋病門診收治的病人，均經Elisa初篩和Western blot確診為HIV-1感染者，診斷均符合2011版本的《艾滋病診療指南》[8]。其中男34例，女31例，年齡16～45歲；健康對照人群10例，全部來自河南中醫學院第一附屬醫院健康體檢者，與HIV感染人群在性別和年齡上均衡可比。65例感染者中11例未接受治療，其余54例為益艾康治療組。益艾康主要藥物組成：人參、黃芪、炒白術、茯苓、當歸、川芎、白芍、黃芩等，具有健脾益氣、養血解毒的功效。服用方法為每日3次，每次5粒，療程6個月以上。所有樣品均在受試對象知情同意的情況下采集抗凝全血。

1.2 CD4+T淋巴細胞絕對計數檢測

已標記好的Trucount管中加入20 μL 抗- FITC-CD3、抗-PE-CD4、抗-PerCP-CD45、抗- APC-CD8混合抗體(BD公司)，后加入50 μL充分混勻的全血振蕩混勻，室溫避光20 min。然后加入450 μL 1 × FACS裂解液，立即振蕩混勻，室溫避光裂解10 min至溶液澄清。利用FACS Calibur流式細胞儀進行檢測，采用MultiSet軟件收集細胞并同時進行分析，得到淋巴細胞亞群相對及絕對計數。

1.3 血漿病毒載量測定

采用COBAS AMPLICOR HIV-1定量檢測試劑盒(Roche公司)在COBAS AMPLICOR全自動PCR檢測儀上定量測定感染者血漿中HIV-1 RNA含量，病毒載量檢測下限為20 copies/ml。

1.4 CD8+T淋巴細胞表面輔助受體CCR5、CXCR4表達水平的測定

取100 μL EDTA抗凝新鮮外周血，加入10 μL FITC-CD8 Ab(BD)、5 μL PE-CXCR4 Ab(BD)、5 μL APC-CCR5 Ab(BD)，混勻后室溫避光標記20 min，然后加入2 ml溶血素，立即振蕩混勻，室溫避光10 min至溶液澄清，1500 r/min離心10 min，除去未結合的熒光抗體后洗滌細胞(2 ml PBS，1500 r/min離心10 min)，將染色好的細胞重懸于300 μL的PBS中，用BD CantoⅡ流式細胞儀獲取數據，Flowjo軟件分析CCR5+/CD8+、CXCR4+/CD8+表達水平。

1.5 CD8+T淋巴細胞表面CD38和HLA-DR表達水平的測定

取100 μL EDTA抗凝新鮮外周血，加入10 μL FITC-CD8 Ab(BD)、10 μL PerCP-HLA-DR Ab(BD)、2.5 μL APC-CD38 Ab(BD)，混勻后室溫避光標記15 min，加入2 ml溶血素立即振蕩混勻，室溫避光10 min至溶液澄清，1500 r/min離心10 min，除去未結合的熒光抗體，加入2 ml PBS溶液洗滌細胞，將標記細胞重懸于300 μL的PBS中，用BD Calibur流式細胞儀獲取數據，Flowjo軟件分析CD38+/CD8+、HLA-DR+/CD8+百分比表達。

1.6 統計學方法

統計學分析及作圖采用Excel 2007、SPSS 16、GraphPad Prism 5完成，采用Mann-Whitney U檢驗比較2組間病毒載量水平差異,多組間比較采用方差分析，相關性分析采用Pearson直線相關或Spearman秩相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD8+T細胞表面輔助受體表達及細胞活化水平流式圖例

圖1、2顯示，利用多色流式細胞表面染色技術檢測CD8+T細胞表面輔助受體(CXCR4/CCR5)及細胞活化水平(HLA-DR/CD38)，健康對照組、HIV未治療組、益艾康治療組3組典型流式圖例。

圖1 健康對照組、HIV未治療組、益艾康治療組CD8+T細胞表面輔助受體表達流式典型圖例

圖2 健康對照組、HIV未治療組、益艾康治療組CD8+T細胞活化水平流式典型圖例

2.2 HIV感染者輔助受體表達與T細胞活化水平相關性研究

圖3顯示，相較健康人群，HIV感染者CD8+T細胞表面CCR5表達升高，CXCR4表達降低。為探討輔助受體的表達是否與細胞活化水平相關，本研究分析了感染者體內CCR5+/CD8+、CXCR4+/CD8+表達水平與CD38+/CD8+、HLA-DR+/CD8+的關系。結果顯示，CCR5+/CD8+表達與CD38+/CD8+、HLA-DR+/CD8+成正相關，CXCR4+/CD8+表達與CD38+/CD8+、HLA-DR+/CD8+成負相關。

2.3 益艾康治療對HIV感染者輔助受體和T細胞活化水平的影響

圖4表1顯示，為揭示益艾康對輔助受體及T細胞活化水平的影響，本研究比較分析了健康對照組、未治療組、益艾康治療組CD8+T細胞表面CCR5、CXCR4、CD38及HLA-DR表達水平，同時分析了不同組別間CD4絕對計數和血漿病毒載量水平。結果顯示，未治療組和益艾康治療組CCR5、CD38及HLA-DR表達高于健康對照，健康人群CXCR4表達高于未治療組和益艾康治療組。健康對照組、未治療組、益艾康治療組CD4 count分別為711、402、476 cells/μL；3組CD38+/CD8+百分比分別為59.76%、80.33%、74.43%；HLA-DR+/CD8+百分比分別為47.51%、68.94%、61.07%；CCR5+/CD8+百分比分別為51.75%、59.41%、56.33%；CXCR4+/CD8+百分比分別為66.48%、43.54%、51.67%。CD4、CXCR4、CD38及HLA-DR的表達在3組之間比較差異有統計學意義。研究結果顯示，益艾康治療組CD4絕對計數和血漿病毒載量水平優于未治療組，益艾康治療可部分恢復輔助受體的表達水平，相較未治療組益艾康治療可使T細胞活化水平接近于正常對照組。

3 討論

趨化因子是屬于細胞因子超家族的一類小分子物質，主要由白細胞分泌通過與靶細胞膜上相應的受體結合而發揮生物學作用，主要功能是通過受體介導而引起粒細胞、單核/巨噬嗜細胞及淋巴細胞的趨化作用遷移和活化，調節造血祖細胞的增殖，趨化因子及其受體在免疫反應、器官發育、腫瘤形成等諸多病理及生理過程中發揮重要作用。趨化因子受體是一類表達于多種細胞表面且能與趨化因子結合的細胞表面蛋白，是具有7次跨膜結構的G蛋白偶聯受體。自1981年美國首次報道艾滋病以來，人們不斷研究其發病機理、病程變化及防治方法，有關趨化因子及其受體與艾滋病的關系日益受到重視。HIV-1感染人體除通過結合T細胞表面的CD4分子外，還需與輔助受體相結合。與HIV感染密切相關的輔助受體主要為趨化因子受體CCR5和CXCR4[9-10]，由于輔助受體在HIV感染及致病過程中的關鍵作用，它們自然成為人們尋找防治艾滋病的重要突破口。

圖3 HIV-1感染者CCR5/CXCR4表達與CD8+T淋巴細胞活化水平(CD38、HLA-DR)的相關性

圖4 健康對照、HIV未治療組、益艾康治療組CD8+T細胞CCR5、CXCR4、CD38、HLA-DR表達比較

組 別例數CD4 count(cells/μL)LogVL(copies/ml)CD38+/CD8+ (%)HLA-DR+/CD8+ (%)CCR5+/CD8+ (%)CXCR4+/CD8+ (%)健康對照組10711±259▲/59.76±10.02▲47.51±17.92▲51.75±13.0966.48±11.62▲未治療組11402±286#4.26(4.08,4.66)80.33±6.37#68.94±10.36#59.41±9.8643.54±9.29#益艾康治療組54476±194#3.99(1.30,4.58)74.43±6.30#▲61.07±15.54#56.33±11.6351.67±10.86#▲F/t值—4.458-0.54625.7866.0320.2618.195P值—0.0270.587<0.0010.0040.7710.001

注： 與健康對照組比較:#P<0.05；與未治療組比較:▲P<0.05

免疫激活包括細胞活化、增殖、凋亡、細胞因子分泌等一系列過程，多種指標均可用來反映免疫激活水平，CD38和HLA-DR表達常用來代表T細胞活化水平，研究表明HLA-DR和(或)CD38雙(單)陽性的細胞比例對于HIV疾病進展具有重要的預測作用[11-12]。本課題組在以往的研究中發現，HIV感染者外周血CD8+T淋巴細胞表面CD38和HLA-DR的表達比例顯著增高；CD4絕對計數結合CD8+T淋巴細胞的活化水平可以更全面地反映HIV感染者免疫功能受損的程度[7]。

益艾康膠囊主要藥物由人參、黃芪、炒白術、茯苓、當歸、川芎、白芍、黃芩等組成，具有健脾益氣、養血解毒的功效，適合脾氣虧虛型HIV/AIDS患者的治療。經過10余年的臨床應用及國家“十一五”科技重大專項“無癥狀HIV感染者中醫藥早期干預研究”初步證實，益艾康膠囊具有改善HIV/AIDS患者臨床癥狀、體征，提高生存質量，減少HIV/AIDS患者機會性感染發生頻次，穩定或提高患者CD4+T淋巴細胞計數，穩定患者病毒載量，對部分患者病毒載量有一定的降低作用[5-6]。益艾康治療HIV的具體作用機制不明確。有研究表明，益艾康膠囊可在一定程度上降低HIV感染者體內調控蛋白基因表達水平，升高Th1細胞百分比。體外實驗發現，益艾康含藥血清能顯著促進NK-92MI細胞增殖和細胞殺傷功能[13]。抗病毒療法在艾滋病患者治療中所出現的不良反應多、藥物價格昂貴、患者依從性差；相反，中藥不僅具有抗HIV病毒作用，還可提高人體免疫功能，其作用平和而持久、毒副作用小。因此，應用或聯合應用中醫藥救治艾滋病患者已成為我國艾滋病防治工作的重要內容。

HIV感染后CD4+、CD8+T細胞表面CCR5和CXCR4表達情況的研究報道較多，較為統一的研究結果提示，HIV感染后T細胞表面CCR5的表達升高，CXCR4表達水平降低。本研究結果表明，相較HIV未治療人群，益艾康膠囊能在一定程度上提高患者CD4水平，同時降低其血漿病毒載量水平。HIV-1感染后T細胞表面CCR5和CXCR4的表達情況與疾病進展和機體免疫反應密切相關，益艾康治療能在一定程度上恢復CD8+T細胞表面CCR5和CXCR4的表達。HIV感染導致輔助受體表達水平變化的確切機制目前尚不明確，有研究者認為輔助受體變化可能與HIV感染后引起機體應激性異常免疫反應有關。在HIV感染中，淋巴細胞表面CD38和HLA-DR表達上升，活化明顯增高，第二受體CCR5主要表達在活化的淋巴細胞表面，而CXCR4則主要表達在靜息細胞表面，相應導致輔助受體CCR5表達增高，CXCR4表達降低[14]。本研究基于CD8+T淋巴細胞表面輔助受體(CCR5、CXCR4)與細胞活化水平(CD38和HLA-DR)關聯性分析，初步探討了輔助受體表達與T細胞活化水平的關系。結果顯示，CD8+T細胞表面輔助受體CCR5表達與細胞活化水平成正相關，CXCR4表達與細胞活化水平成負相關。與未治療人群比較，益艾康治療可在一定程度上恢復感染者T細胞輔助受體及活化水平，改善艾滋病病毒感染后的免疫損傷。

綜上，隨著疾病進展，HIV感染者CD8+T淋巴細胞活化水平及輔助受體的表達出現明顯變化，細胞活化水平與輔助受體表達的確切因果關系及其明確機制還有待進一步的研究。益艾康治療可部分恢復輔助受體和細胞活化水平的變化，改善病人的免疫損傷，這為益艾康的作用機制研究提供了思路。