健脾益氣方對(duì)HIV/AIDS患者病毒載量與IL-2、IL-13、IFN-γ變化影響及相關(guān)性分析*

李 杰，李 強(qiáng)，桑 鋒，劉 真，王丹妮，徐立然

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院艾滋病臨床研究中心，河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450000)

HIV病毒侵入人體后主要破壞CD4+T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致HIV/AIDS患者細(xì)胞免疫功能降低,失去對(duì)外界抗原的抵抗力，從而誘發(fā)感染、皮疹及惡性腫瘤等，最后可導(dǎo)致死亡。健脾益氣方由人參、黃芪、炒白術(shù)等藥物組成，具有健脾益氣、養(yǎng)血解毒之功效。以健脾益氣為基礎(chǔ)的益艾康膠囊2004年被國(guó)家納入5省中醫(yī)藥治療艾滋病重點(diǎn)藥物，經(jīng)過(guò)10余年的臨床應(yīng)用及初步研究證實(shí)，益艾康膠囊能夠改善HIV/AIDS患者臨床癥狀，提高患者生存質(zhì)量，降低病死率[1-2]。研究表明，細(xì)胞因子IL-2、IL-13、IFN-γ對(duì)免疫功能具有調(diào)節(jié)作用，提高CD4+T細(xì)胞增殖水平及免疫細(xì)胞抗HIV感染活性，進(jìn)而對(duì)HIV病毒復(fù)制產(chǎn)生一定影響。探討HIV/AIDS患者病毒載量(簡(jiǎn)稱(chēng)VL)和細(xì)胞因子治療前后變化差異及其相關(guān)性，對(duì)研究健脾益氣方在HIV治療中的作用機(jī)制有重要意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及入選標(biāo)準(zhǔn)

艾滋病診斷參照《艾滋病診療指南》(2015版)[3]。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合HIV/AIDS診斷標(biāo)準(zhǔn)者；年齡在18～60歲之間；自愿參與本次試驗(yàn)并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他感染性疾病，如乙肝、梅毒、結(jié)核等；合并嚴(yán)重自身免疫性疾病、腫瘤及神經(jīng)系統(tǒng)損害者；患有嚴(yán)重心、腦血管疾病，嚴(yán)重肝、腎及造血系統(tǒng)疾病者；過(guò)敏體質(zhì)、孕婦或哺乳期及精神病者。

1.2 方法

1.2.1 一般人口學(xué)信息 研究對(duì)象采集信息包括年齡、性別、婚姻狀況、文化程度、職業(yè)及可能感染途徑等。

1.2.2 樣本收集與分組 結(jié)合納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，以本實(shí)驗(yàn)室保存樣本為基礎(chǔ)，選擇河南省某AIDS高發(fā)地區(qū)28例HIV/AIDS患者為研究對(duì)象，收集患者治療1年前后樣本并分離血漿保存?zhèn)溆谩０囱獫{病毒載量水平將樣本分成4組。Ⅰ組：未檢測(cè)到HIV RNA(VL=0)；Ⅱ組：低于檢測(cè)下限(VL=20copies/ml)；Ⅲ組：201000 copies/ml。

1.2.3 血漿病毒載量檢測(cè) 取1 ml血漿加入S-tube管中，采用Roche公司COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 全自動(dòng)病毒載量?jī)x檢測(cè)血漿病毒載量，試劑盒版本為HIV-1 Test, v2.0。檢測(cè)方法為Real-time PCR(探針?lè)?定量檢測(cè)血漿中HIV RNA，擴(kuò)增的靶核酸位于 HIV gag 區(qū)。試劑為內(nèi)標(biāo)法設(shè)有陰性質(zhì)控品、弱陽(yáng)性質(zhì)控品和強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品各1個(gè)，檢測(cè)線性范圍20-10×107RNA copies/mL。

1.2.4 IL-2、IL-13、IFN-γ細(xì)胞因子檢測(cè) 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：取出-80 ℃保存樣品冰上融化，取25 μL血漿樣品用Sample Diluent 4倍稀釋?zhuān)?0 μL上機(jī)備用； 將標(biāo)準(zhǔn)品用500 μL Standard Diluent稀釋?zhuān)匆筮M(jìn)行4倍比稀釋?zhuān)?0 min后使用。微珠、檢測(cè)抗體和Streptavidin-PE熒光色素準(zhǔn)備：微珠稀釋前漩渦混合30 s冰浴，避光保存直至使用。以每孔50 μL計(jì)算，用Assay Buffer將微珠(10×)稀釋為1×；以每孔25 μL計(jì)算，用Detection Antibody Diluent將檢測(cè)抗體(10×)稀釋為1×；以每孔50 μL計(jì)算，用Assay Diluent將Streptavidin-PE稀釋100倍，10 min使用完畢。實(shí)驗(yàn)操作流程：將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品室溫平衡20 min以上；漩渦混合稀釋好的微珠15～20 s，每孔加入50 μL；將孔板置于真空泵上洗滌2次，按照板子設(shè)計(jì)加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，每孔50 μL避光， 850-900RPM搖床避光孵育1 h；洗板3次，每孔加入檢測(cè)抗體25 μL，避光孵育30 min；洗板3次，每孔加入Streptavidin-PE 50 μL，避光孵育10 min；洗板3次，每孔加入125 μL Bio-Plex Assay Buffer重懸微珠，振蕩30 s，上機(jī)讀板檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)儀器采用Bio-Rad公司Bio-Plex 200高通量細(xì)胞因子檢測(cè)系統(tǒng)，使用Low PMT設(shè)置進(jìn)行讀板獲取數(shù)據(jù)，檢測(cè)結(jié)果單位為pg/ml。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般人口學(xué)特征

表1顯示，28例HIV/AIDS患者的人口學(xué)特征。

表1 28例HIV/AIDS患者基本信息分布[例(%)]

2.2 治療前后血漿病毒載量、IL-2、IL-13、IFN-γ水平比較

表2顯示，健脾益氣方治療1年前后血漿病毒載量、IL-2、IL-13、IFN-γ檢測(cè)結(jié)果顯示，病毒載量在治療前后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但I(xiàn)L-2、IL-13、IFN-γ治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即健脾益氣方治療1年后血漿IL-2、IL-13與IFN-γ水平比較治療前均有所升高。

2.3 不同病毒載量水平組間IL-2、IL-13、IFN-γ水平比較

表3顯示，治療前后IL-2、IL-13與IFN-γ組間比較顯示，治療前后不同病毒載量水平組間IL-2和IFN-γ水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IL-13水平在治療前后組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IL-132組間比較結(jié)果顯示，治療前Ⅰ組與Ⅲ組、Ⅰ組與Ⅳ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后Ⅱ組與Ⅲ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即隨著病毒載量水平增加血漿IL-13水平有所增加。

表2 健脾益氣方治療前后血漿病毒載量、IL-2、IL-13與IFN-γ水平變化比較

表3 不同病毒載量水平組間IL-2、IL-13、IFN-γ水平變化

注：與Ⅰ組比較:aP<0.05；與Ⅱ組比較:bP<0.05；與Ⅲ組比較:cP<0.05；與Ⅳ組比較:dP<0.05

2.4 治療前后病毒載量與IL-13相關(guān)性分析

表4顯示，病毒載量與IL-13在治療前后均呈現(xiàn)中度正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

表4 治療前后病毒載量與IL-13的關(guān)系

3 討論

IL-2與IFN-γ主要由Ⅰ型輔助性T細(xì)胞(Th1)產(chǎn)生具有誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，抑制病毒復(fù)制的功能，在抗病毒、抗細(xì)菌感染和抗腫瘤等疾病的治療中已得到廣泛應(yīng)用[4]。IL-13主要由Ⅱ型輔助性T細(xì)胞(Th1)產(chǎn)生，它能有效抑制單核細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)IgE合成，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)某些黏附分子及抑制HIV-1病毒復(fù)制[5]。據(jù)報(bào)道，在HIV感染早期，隨著HIV病程發(fā)展由Th1細(xì)胞分泌的IL-2和IFN-γ水平逐漸下降，同時(shí)Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平逐漸升高，因此細(xì)胞因子水平的變化與HIV疾病進(jìn)展有很大相關(guān)性[6]。

T細(xì)胞亞群檢測(cè)和血漿病毒載量水平變化一直以來(lái)都是反映疾病進(jìn)展的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但在健脾益氣方治療前后病毒載量無(wú)明顯變化，說(shuō)明該中藥治療法在直接降低血漿HIV病毒載量水平方面與HAART療法比較并無(wú)優(yōu)勢(shì)[7]。相反，IL-2、IL-13、IFN-γ細(xì)胞因子水平在治療后有明顯升高，這可能成為健脾益氣方調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能狀態(tài)、刺激免疫功能重建的作用機(jī)制[8-9]。不同病毒載量水平組間3種細(xì)胞因子差異表現(xiàn)不盡相同，其中IL-2與IFN-γ治療前后變化不明顯，而IL-13水平在治療前后組間有明顯差異，并與病毒載量的相關(guān)性較好，這與文獻(xiàn)報(bào)道中IL-13能顯著降低HIV病毒的感染性，影響病毒DNA合成相一致[10]。

總之， IL-2、IL-13與IFN-γ細(xì)胞因子檢測(cè)在評(píng)價(jià)健脾益氣方治療HIV/AIDS患者臨床療效方面有重要意義，但是將其作為免疫監(jiān)測(cè)的工具，為臨床治療提供客觀依據(jù)還有待進(jìn)一步的研究。