保元排毒丸對單側輸尿管梗阻大鼠腎小管上皮細胞轉分化的影響*

王身菊，唐麗君，邵 馨，朱美鳳，鄭宏香，陳 岱

(南京中醫藥大學附屬常州市中醫醫院，江蘇 常州 213000)

慢性腎臟病(chronic kidney disease CKD)是臨床常見病、多發病，其發病率和病死率逐年升高，已成為目前全球亟待解決的健康問題[1]。原發性腎小球疾病、糖尿病腎病、梗阻性腎病等各種CKD的結局都是腎纖維化，如何防治腎纖維化是大家面對的共同難題。中醫中藥在防治腎纖維化方面有一定的優勢，本課題組采用保元排毒丸治療CKD患者，取得了較滿意的臨床療效[2-4]。本研究通過制作UUO大鼠腎臟纖維化模型，觀察保元排毒丸對UUO模型大鼠腎小管上皮轉分化的影響，以探討保元排毒丸延緩腎纖維化的可能機理。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性SD大鼠48只，7～8 周齡，體質量(190±8) g，購自南京醫科大學實驗動物中心(動物生產許可證號碼SCXK(蘇)2016-0002)。進食標準普通飼料，自由飲水，日常光照，適應性飼養3 d后進入實驗。

1.2 實驗藥品

保元排毒丸(藥物批號160902)來源于南京中醫藥大學附屬常州市中醫醫院制劑室，由生黃芪70 g、黃精35 g、冬蟲夏草3. 5 g、生曬參1.75 g、生大黃21 g、丹參35 g、六月雪70 g、接骨木70 g等藥物組成，水泛蜜丸，每丸重 0.14 g，相當于生藥含量的0.38 g。厄貝沙坦(商品名：安博維)150 mg/片，由賽諾菲杭州制藥有限公司生產。

1.3 主要試劑

蘇木素-伊紅染液、Masson染色試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司)，DAB 顯色試劑盒(DAKO)，TRIS(Solarbio T8060)，Trizol Reagent、BCA蛋白定量檢測試劑盒及SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)，兔源性E-cadherin抗體(三鷹公司，貨號20874-1-AP)，鼠源性а-SMA抗體(Boster，貨號BM0002)。

1.4 主要儀器

JJ-12 J型脫水機、JB-P5包埋機(武漢俊杰電子有限公司)，烤箱、RM2016病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)，NIKON ECLIPSE CI正置光學顯微鏡。752-P紫外分光光度計(上?，F科儀器有限公司)，neofuge 15R冷凍離心機(heal force)，DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)，alphaEaseFC灰度分析軟件(Alpha Innotech)，Stepone plus熒光定量PCR儀(ABI)，多樣品研磨珠均質儀(Omni)。

2 方法

2.1 分組及UUO大鼠模型建立

48只健康清潔級雄性SD大鼠，適應性飼養3 d后按隨機數字表分為假手術組、UUO組、保元排毒丸低劑量組、保元排毒丸中劑量組、保元排毒丸高劑量組和厄貝沙坦組6組各8只。除假手術組外，其余各組均按文獻方法[5]造模。以3%戊巴比妥鈉，按照0.2 m L/100 g 腹腔注射麻醉，麻醉成功后固定大鼠，剃去右背部毛發暴露皮膚，聚維酮碘消毒皮膚3遍，鋪無菌手術巾。在距脊柱約1～1.5 cm，肋緣下做長約 1～1.5 cm縱行切口，逐層剝離皮下筋膜，切開肌肉暴露出腎盂及輸尿管，玻璃分針分離出右輸尿管，近腎盂處結扎輸尿管2次，從兩結扎中間剪斷輸尿管后逐層縫合關閉腹腔，以聚維酮碘消毒皮膚切口，用無菌敷料覆蓋包扎。假手術組只分離右輸尿管不結扎，然后逐層縫合。

2.2 給藥

將保元排毒丸溶于蒸餾水中，分別配成濃度為25%、12.5%、6.25%的溶液，放置冰箱冷藏以備用。造模第2天開始給藥共灌胃14 d，保元排毒丸低、中、高劑量組分別給予保元排毒丸1.25 g·kg-1d-1、2.5 g·kg-1d-1、5.0 g·kg-1d-1，厄貝沙坦組給予厄貝沙坦12.5 mg·kg-1d-1，假手術組和UUO組給予自由進食及等容積生理鹽水灌胃。

2.3 觀察指標及檢測方法

2.3.1 尿蛋白、血肌酐、尿素氮測定 于末次灌胃后放入代謝籠，禁食不禁水，收集24 h尿液，紙片法測24 h尿蛋白定量；末次灌胃24 h后眼眶采血，并通過全自動生化分析儀檢測血肌酐和尿素氮。

2.3.2 腎組織病理 于末次灌胃24 h后同前法麻醉后取右腎剔除包膜，用無菌紗布吸干水分，電子天平稱取右側腎臟濕重后，縱切一半右腎置于4%多聚甲醛中固定；右腎另一半分裝于EPP管中于-80 ℃保存，待進一步檢測。固定24 h后，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，切4.0 μm薄片。按試劑盒方法進行HE、Masson染色，顯微鏡下觀察腎臟病理學改變，按Banff 分級進行 0～3級半定量計分，記錄連續不重疊的10個200 倍視野數值，取其平均值比較每例切片的腎小管間質區域病變程度及腎纖維化程度。

2.3.3 免疫組化測腎組織E-cadherin、а-SMA表達 將4 μm石蠟切片脫蠟至水后，沸水浴實施抗原修復15 min， PBS(PH7.4)洗滌3次，每次5 min；3%過氧化氫溶液(雙氧水：純水=1∶9)，室溫避光孵育25 min，PBS洗滌3次，每次5 min； 3% BSA封閉，加相應的一抗 (E-cadherin抗體1∶200，α-SMA抗體1∶100稀釋)，4 ℃濕盒內孵育過夜；PBS(PH7.4)洗滌3次，加入HRP標記的二抗完全覆蓋切片組織，于37 ℃ 下孵育45 min，PBS洗滌3次，二氨基聯苯胺 (DAB) 顯色，蘇木素淡染細胞核1 ～ 3 min，脫水透明后使用中性樹膠封片；假手術組用PBS代替上述一抗。顯微鏡下以棕黃色顆粒為陽性，每張切片在高倍鏡(200倍) 下隨機選取10 個不重疊視野。使用Image Pro-Plus 6 軟件測定累積光密度(integrated optical density，IOD)為統計值進行半定量分析。

2.3.4 Western Blot法測腎組織E-cadherin、а-SMA表達水平 取保存于-80 ℃的腎組織，用冷PBS洗滌2～3次，去除血污剪成小塊置于勻漿器，加入適量裂解液后冰上徹底勻漿。1500 g離心10 min，收集上清即為總蛋白溶液，BCA法測蛋白濃度。每上樣孔加4 μg 總蛋白行10% SDS-PAGE 膠電泳。濕轉法電轉移至PVDF 膜，用封閉液封閉1 ～ 2 h后，各組分別加入適當稀釋后的E-cadherin(1∶2000)、а-SMA(1∶2000)抗體4 ℃ 過夜。辣根過氧化物酶(HRP) 標記的二抗用TBST稀釋3000倍，室溫孵育30 min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min，化學發光劑 ECL 反應5 min曝光，掃描蛋白條帶，將膠片進行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統分析所測得的各指標吸光度與內參照GAPDH吸光度的比值代表定量值。

2.4 統計學方法

3 結果

保元排毒丸高劑量組在造模過程中因麻醉而死亡1只。

3.1 尿蛋白、血肌酐、尿素氮測定

表1顯示，與假手術組比較，UUO組血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白定量均有增高(P<0.01)；與UUO組比較，保元排毒丸各劑量組血尿素氮和尿蛋白定量均明顯降低(P<0.01)，保元排毒丸低、中、高劑量組血肌酐有不同程度降低(P<0.05，P<0.01)；保元排毒丸各劑量組之間血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白定量無明顯差異，保元排毒丸高劑量組尿蛋白低于厄貝沙坦組(P<0.05)。

表1 各組血尿素氮、肌酐、24 h尿蛋白定量及腎組織E-cadherin和а-SMA比較

注：與假手術組比較：◆◆P<0.01；與UUO組比較：#P<0.05，##P<0.01；與厄貝沙坦組比較：☆P<0.05

1～6組分別表示假手術組、UUO組、厄貝沙坦組、保元排毒丸低劑量組、保元排毒丸中劑量組和保元排毒丸高劑量組。

3.2 腎組織 HE 染色和 Masson 染色

圖1顯示，UUO組大部分腎小管管腔擴張明顯，腎小管上皮細胞部分溶解、脫落，部分腎小管萎縮或塌陷，部分可見有蛋白或細胞管型，腎間質彌漫性炎性細胞浸潤。保元排毒丸低、中、高劑量組和厄貝沙坦組見腎小管上皮細胞結構較完整，間質炎細胞浸潤比UUO組減少，腎小管擴張減輕(P<0.01)。厄貝沙坦組與保元排毒丸各劑量組的病理變化大致相當。

注：A.UUO組； B.假手術組； C.厄貝沙坦組；D.保元排毒丸低劑量組；E.保元排毒丸中劑量組； F.保元排毒丸高劑量組(下同)圖1 各組大鼠腎組織HE 染色(×200)

圖2顯示，UUO組見增寬的間質有較多藍紫色條索狀膠原沉積，假手術組腎小管間質、小球基底膜及系膜區無明顯膠原沉積腎；保元排毒丸各劑量組和厄貝沙坦組藍紫色膠原沉積明顯少于UUO組(P<0.01)。

圖2 各組大鼠腎組織Msson染色(×200)

3.3 腎組織E-cadherin和а-SMA表達

圖3表1顯示，假手術組E-cadherin表達主要分布于遠端小管和集合管， 主要位于腎小管上皮細胞的胞漿基底側， UUO組E-cadherin表達明顯弱，非常少量地表達于腎小管上皮細胞的胞漿中。與UUO組比較，保元排毒丸各劑量組的E-cadherin蛋白表達均明顯上調(P<0.05)，保元排毒丸各劑量組和厄貝沙坦組E-cadherin蛋白表達無明顯差異。

圖3 各組大鼠腎組織E-cadherin表達(免疫組化)(×400)

圖4 各組大鼠腎組織а-SMA表達(免疫組化)(×400)

圖4表1顯示，假手術組а-SMA表達以血管為主，腎間質及上皮細胞未見明顯表達；UUO組а-SMA 表達明顯增強(P<0.01)，以擴張的腎小管表達為強，間質亦可見到陽性表達； 保元排毒丸各劑量組的а-SMA表達以擴張的腎小管為主，間質可見少量表達，明顯少于UUO組(P<0.01)。

3.4 Western Blot法測 E-cadherin、а-SMA表達

圖5表1顯示，與假手術比較UUO組E-cadherin表達明顯減少(P<0.01)，а-SMA的表達明顯增強(P<0.01)；與UUO組比較，保元排毒丸各劑量組的E-cadherin表達明顯增強(P<0.01)，а-SMA的表達明顯減少(P<0.01)。

圖5 各組大鼠腎組織E-cadherin、а-SMA蛋白的表達(Western Blot法)注：A.UUO組； B.假手術組； C.厄貝沙坦組；D.保元排毒丸低劑量組；E.保元排毒丸中劑量組； F.保元排毒丸高劑量組

4 討論

CKD的共同病理表現是腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)，主要表現為小管損傷壞死，膠原、纖維連接蛋白和層黏連蛋白等細胞外基質的沉積[6]。常沉積的細胞外基質以Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原為主，主要由肌成纖維細胞分泌產生。研究發現，1/3以上的腎間質肌成纖維細胞起源于腎小管上皮細胞[7]。腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化，(epithelial-mesenchymal transformation，EMT) 在合成肌成纖維細胞的發生發展過程中起重要作用[8]。腎小管上皮細胞在炎癥、缺血、缺氧等因素影響下，丟失上皮細胞的表型，轉化為具有分泌功能的肌成纖維細胞的過程，即腎小管上皮細胞轉分化(TEMT)[9]。腎小管上皮細胞轉分化形成肌成纖維細胞，直接參與腎間質纖維化的進程，是腎纖維化的重要機制之一[10]。а-SMA是肌成纖維細胞合成的一種特征性蛋白，在腎間質纖維化發生發展過程中，а-SMA陽性肌成纖維細胞是導致腎間質纖維化的主要細胞[11]。а-SMA是肌成纖維細胞的特異性標志物。上皮細胞的黏附能力喪失，Ecadherin表達缺失或減弱是腎小管上皮細胞轉分化的標志[12]。本實驗選用E-cadherin和а-SMA作為EMT的標志。

保元排毒丸為全國名中醫張志堅治療CKD的經驗方。張志堅認為，腎病的發生不外乎先天稟賦異常、后天失養或勞作過度、冒雨涉水受風而發，風邪或從上受，或由外而內蘊伏于腎，風為百病之長，易傷肺脾腎，故肺脾腎虛損常為本病的素因，而以脾腎虛損為重；脾虛生濕，濕蘊成濁、濁聚成毒，久病致瘀入絡，風濕瘀交阻病情纏綿難愈。針對慢性腎衰共性核心病機“脾腎兩虛、風濕瘀阻”，提出脾腎氣陰兩虛、風濕瘀阻證為慢性腎衰最常見證型，慢性腎衰的基本治法為益腎健脾、祛風清利、化瘀泄濁。據此病機研制保元排毒丸，主要由生黃芪、黃精、人參、冬蟲夏草、丹參、接骨木、生大黃、六月雪等中藥組成。方中生黃芪補肺固表、利水消腫；黃精平補肺脾腎；人參大補元氣、補脾生津；冬蟲夏草甘溫益氣、保肺補腎；紫丹參活血祛瘀；接骨木祛風利濕、活血化瘀；六月雪清熱利濕；生大黃苦寒瀉下、蕩滌腸胃、降泄濁邪。諸藥相伍，補瀉兼施，清消并用，共奏益腎健脾、祛風清利、化瘀泄濁之功，治療CKD臨床療效可靠[2-4]。

單側輸尿管梗阻大鼠模型是一種研究腎間質纖維化發生機制、腎臟細胞轉分化和評價腎間質纖維化療效的理想模型[13]。本實驗UUO組腎小管、腎間質病變重，腎纖維化重，表明UUO模型成功，UUO組血肌酐、尿素氮均高于各給藥組。從臨床經驗看，單側輸尿管梗阻不至于引起血肌酐和尿素氮的升高，因為腎臟具有強大的代償能力，這點鼠與人的結果不太一致。也有學者[14-15]得出了同樣的實驗結果，單側輸尿管梗阻大鼠術后2周血肌酐升高，有可能是大鼠對急性腎損傷的代償能力弱于人。UUO組24 h尿蛋白定量升高，保元排毒丸低、中、高劑量組和厄貝沙坦組24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮均明顯低于UUO組，表明保元排毒丸有降低血肌酐、尿素氮和蛋白尿的作用。保元排毒丸高劑量組蛋白尿水平低于厄貝沙坦組，提示保元排毒丸降蛋白尿的作用可能優于厄貝沙坦組，這需要在今后的動物實驗和臨床中進一步觀察。與UUO組比較，保元排毒丸低、中、高劑量組和厄貝沙坦組腎小管、腎間質病變明顯減輕，腎纖維化減輕，提示保元排毒丸有延緩腎間質纖維化的作用。免疫組化和Western Blot均證實，UUO組E-cadherin表達減少，а-SMA表達明顯增多，說明模型組大鼠腎組織發生了轉分化。保元排毒丸低、中、高劑量組E-cadherin表達明顯高于UUO組，а-SMA表達明顯低于UUO組，表明保元排毒丸有抑制腎小管上皮轉分化的作用。至于保元排毒丸通過何種途徑抑制腎小管上皮轉分化需要進一步探討。

綜上所述，保元排毒丸能降低UUO大鼠24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮延緩腎纖維化，其機理可能與抑制腎小管上皮轉分化有關。